Ммунодиагностика. Оценка иммунного статуса человека.

Одна из задач клинической иммунологии – полная оценка функционирования иммунной системы в норме и при заболеваниях человека. Коррекция иммунопатологических процессов в силу различий механизмов их развития не может быть одинаковой и должна предваряться проведением методов исследования иммунной системы, позволяющих максимально точно установить вариант иммунопатологического процесса. Для установления характера иммунопатологических изменений необходимы специальные методы диагностики иммунной системы. Иммунодиагностика – проведение лабораторного и клинического исследований, которые помогают выявить конкретные нарушения в иммунной системе, позволяющие: диагностировать конкретное заболевание, определить иммунопатогенез выявленного заболевания, разработать алгоритм индивидуальной иммунокоррекции и проконтролировать ее эффективность, провести мониторинг состояния иммунной системы. Методы иммунодиагностики используются не только для исследования иммунной системы, инфекционных заболеваний, но и для диагностики онкологических процессов, заболеваний эндокринной системы и многих других. Отчасти это связано с вовлечённостью иммунной системы в самые разные по этиологии и патогенезу заболевания в рамках единства нейро-иммуно-эндокринной регуляции гомеостаза, отчасти – с использованием иммунологических подходов в изготовлении реактивов, тест-систем для исследования практически любых молекул и клеток. Все методы диагностики состояния иммунной системы можно разделить на несколько групп. Некоторые методы выполняются врачом клинической практики, другие – специалистами в области инструментальной диагностики, третьи – специалистами лабораторного профиля. В силу разнообразия используемых методов, диагностика состояния иммунной системы осуществляется на многоуровневой основе:

1-й уровень имеет ориентировочное значение и предназначен для констатации наличия вероятности неадекватного функционирования иммунной системы. Это клинический уровень, он предполагает сбор анамнеза пациента, изучение его жалоб и установление клинических маркёров изменённой функции иммунной системы путём физикального осмотра. Заподозрить нарушение функции иммунной системы можно при наличии у пациента частых (свыше 4 раз в год) и длительных респираторных инфекций, которые протекают без температурной реакции, при длительном субфебрилитете, снижении или существенном увеличении массы тела, наличии гнойничковых заболеваний кожи, наличие признаков аллергии, при нарушении функционирования желудочно-кишечного тракта, увеличении регионарных лимфоузлов и др. При физикальном осмотре врач обращает внимание на состояние кожных покровов, волос и ногтей, состояние слизистых оболочек полости рта, на размеры и консистенцию регионарных лимфоузлов, селезёнки. По результатам данного обследования можно предположить изменение функции иммунной системы и целенаправленно продолжить диагностику её состояния.

2-й уровень диагностики – инструментальный. Он используется не всегда, поскольку его возможности ориентированы на визуализацию различных внутренних органов, включая органы иммунной системы. К методам инструментальной диагностики относят рентгенологическое, ультразвуковое исследование и смежные с ними методы. Их диагностическая ценность связана с обнаружением объёмных образований или изменения размеров органа, что чаще всего сопровождает опухолевые процессы (в рамках патологии иммунной системы - лимфопролиферативные процессы).

3-й уровень диагностики – лабораторный. Именно этот уровень позволяет получить максимум информации о функционировании молекул и клеток иммунной системы, что очень важно для постановки диагноза патологии иммунной системы или определения её вовлечённости в патологический процесс.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для исследования иммунной системы используются следующие материалы: цельная кровь, сыворотка крови (жидкая фракция крови, освобожденная от фибриногена), плазма крови (жидкая фракция крови, содержащая фибриноген, способная к образованию сгустков фибрина), клетки крови, оделенные от жидкой фракции, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, выделение слизистых секретов половых органов (канал шейки матки, влагалища, семенная жидкость), выделение из носа (смывы или адсорбция на пористые материалы), моча, супернатанты, полученные от культивируемых in vitro клеток, гомогенаты тканей (биопсия или post mortem). Цитоплазматические и ядерные компоненты клеток. Биологический материал разного происхождения отличается по биохимическому составу, pH, ионной силе, вязкости. Все эти параметры имеют существенное значение для реализации связывания с антигенами, используемыми для тестирования. Поэтому каждая конкретная тест-система разработана строго для конкретного вида биоматериала и в 99% случаев – для сыворотки крови. Тест-системы для анализов компонентов сыворотки не могут быть использованы в опытах с другими биологическими жидкостями из-за высокой вероятности получения ложных результатов. Тест-системы, предназначенные для человека (за некоторыми исключениями), нельзя применять на лабораторных животных и наоборот. Исключение составляют перекрестно-реагирующие агенты, например цитокин- трансформирующий фактор роста человека и свиньи.

Все перечисленные материалы можно условно разделить на 2 группы – 1-я – универсальные материалы, которые исследуются у каждого пациента с предполагаемым нарушением функции иммунной системы (периферическая кровь), 2-я – специализированные материалы, исследуемые в отдельных случаях и представляющие собой, как правило, материал из очага патологического процесса.

Периферическая кровь, как биологический материал для исследования, отличается доступностью для взятия, но имеет ряд ограничений в плане достоверности и диагностического значения получаемой информации. Кровеносная система является одной из транзитных для лимфоцитов систем. В кровеносном русле находится не более 0,5 % всех имеющихся в организме лимфоцитов и их изучение не всегда позволяет получить информацию о состоянии иммунной системы, так как большинство процессов физиологической и патологической активации этих клеток осуществляется на территории органов иммунной системы или различных тканей. Поэтому уровень значимости получаемой информации различен при разных патологических состояниях, а для получения достоверной информации о состоянии иммунной системы нужен комплекс методов.

Иммунологические методы, применяемые как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, делятся на 8 групп.

I. Методы определения или детекции тех или иных веществ, характеризующихся наличием уже полученных специфических антител против них. Эти методы принято называть в международной специальной литературе методами иммуноанализа. В соответствии с применяемыми технологиями визуализации взаимодействия антитела и антигена иммуноанализ подразделяется на: методы агглютинации корпускулярных антигенов (непосредственная агглютинация антигена, гемагглютинация, латекс-агглютинация, нефелометрия); методы с использованием технологии гемолиза (тесты фиксации комплемента, торможения фиксации комплемента, метод подсчета антителообразующих клеток по Йерне); методы преципитации комплексов «антиген-антитело» в гелях (методы Охтерлони, Элека, Манчини и др.); иммунноферментный анализ, радиоиммунный анализ, иммунофлюресцентный анализ – наиболее высокочувствительные и наиболее употребимые в настоящее время виды иммуноанализа.

II. Методы фракционирования – физическое разделение растворимых молекул или клеток иммунной системы: выделение иммуноглобулинов высаливанием солями серной кислоты; методы хроматографии (высокоэффективная, аффинная и др.); центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности (выделение мононуклеарных клеток центрифугированием на фиколл-гепаке; выделение нейтрофилов седиментацией на растворе желатина, декстрана и др.); электрофорез; проточная цитофлюорометрия, в том числе с использованием тетрамерных комплексов.

III. Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная микроскопия, микроскопия препаратов тканей или клеток с фиксированными антителами, меченными ферментной меткой).

IV. Методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция, иммуноблоттинг: Western-блот определяет белок, Southern-блот определяет ДНК, Northern-блот определяет РНК).

V. Генетические методы: методы направленного мутагенеза – «нокаут» и «нокин»; методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования конкретных мутаций (технологии микроэреев).

VI. Методы биотехнологии– клонирование молекул, ПЦР, методы получения рекомбинантных белков, клеток (гибридомные технологии), создание линий инбредных животных, биотехнологические методы получения и оценки вакцин.

VII. Методы изучения нативных свойств клеток иммунной системы в культурах in vitro (методы биологического тестирования цитокинов; методы оценки пролиферации клеток; методы исследования факторов транскрипции и др.).

VIII. Методы исследования функций и взаимодействия клеток in vivo (радиационные химеры; сканирование меченых клеток in vivo и др.).

Реакции агглютинации - это реакции склеивания корпускулярных антигенов (микробы, эритроциты и т.д.) специфическими антителами. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эти реакции проводят для определения наличия определенных антигенов или антител. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных из организма или трупа. Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла и в организме присутствует тот антиген, к которому были антитела (известные) в исходной сыворотке. Также эту реакцию проводят в пробирке: в несколько пробирок наливают исследуемую сыворотку крови с неизвестными антителами, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадет осадок.

Реакция преципитации.В основе механизма этой реакции лежит выпадение из раствора нерастворимого комплекса антиген-антитело. Реакция преципитации позволяет обнаруживать малые количества белкового антигена (до разведения 1:1 000 000). Она в этом отношении чувствительнее многих химических реакций, хотя в свою очередь уступает по чувствительности реакции связывания комплемента и анафилаксии. Реакция преципитации нашла широкое применение для определения степени родства видов животных и растений.Реакция преципитации основана на взаимодействии антигенов и антител в эквивалентных количествах. Кольцепреципитация — появление непрозрачного кольца преципитата при постепенном наслаивании растворимого антигена на иммунную сыворотку. Например, для определения антигенов сибирской язвы используют сыворотку крови иммунизированных лошадей, при этом кольцо преципитата появляется в течение 2 мин. Также эту реакцию можно проводить на твердых средах (агаре). При этом в два углубления среды помещаются сыворотка и взвесь бактерий, зона преципитации образуется между ними. Эти реакции используются для определения антигенов бактерий, тканей человека и животных, диагностики некоторых инфекционных заболеваний, определения видовой принадлежности белка в судебной медицине.Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата. Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде — по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток. Реакцию кольцепреципитации применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Метод радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле антигена (в данном случае иммуноглобулина исследуемой сыворотки) и антитела (антител к иммуноглобулинам человека, содержащимся в стандартных антисыворотках). Реакция иммуноэлектрофореза используется в основном для определения моноклональных иммуноглобулинов, например парапротеинов при миеломной болезни или макроглобулинемии Вальденстрема. Метод представляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки крови (или других биологических сред) и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов. Методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против антител определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результате реакции антиген-антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жидкости. В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале. Реакция связывания комплемента (РСК) проводится с участием не только антигена и антитела, но и комплемента. Так как она не сопровождается видимыми изменениями, для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика. В присутствии комплемента в гемолитической сыворотке происходит хорошо наблюдаемый лизис эритроцитов. Принцип метода состоит в том, что если в опыте образовался комплекс антиген-антитело и с ним связался комплемент (т.е. в растворе свободного комплемента не останется), то лизиса эритроцитов не произойдет и они осядут на дно пробирки. Если комплекс не формируется, то комплемент остается свободным и реагирует с гемолитической системой, вызывая лизис эритроцитов. Этот механизм лежит в основе реакции Вассермана (диагностика сифилиса). Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей антитела к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиза эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания антител с антигеном - комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, образуется иммунный комплекс, и происходит связывание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов. В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20-40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических - ее снижение. Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при следующих заболеваниях и синдромах:

1. Рецидивирующие бактериальные пиогенные инфекции органов дыхания, кожи и других органов: пневмонии, бронхоэктазы, рецидивирующий синусит, пиодермия, генерализованные бактериальные инфекции, септицемия.

2. Рецидивирующие менингококковые и гонококковые инфекции (менингококковый менингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.).

3. Аутоимунные, аллергические заболевания и болезни иммунных комплексов: системная красная волчанка, дерматомиозит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, болезнь Шенлейн-Геноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический отек (особенно часто - ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др.

Реакция связывания комплемента используется для лабораторной диагностики риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, клещевой энцефалит и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + АТ. Комплемент адсорбируется на Fc-фрагменте иммуноглобулинов G и М. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флуоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционноспособные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом. С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. При некоторых заболеваниях внутренних органов, в развитии которых имеет значение процесс иммунного воспаления или иммунной агрессии, в сыворотке крови можно обнаружить аутоантитела к гладкой мускулатуре, эритроцитам, иммуноглобулинам, митохондриям, антиядерные (антинуклеарные) антитела, антитела к ДНК, противоопухолевые антитела и др. Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является метод иммунофлуоресценции, имеющий несколько модификаций и протекающий в два этапа. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином. Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. — enzyme-linked immunoSorbent assay, ELISA) - лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов.

Иммуноферментный метод основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу. В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип взаимодействия иммуносорбента - антигена возбудителя инфекции - с выявляемыми антителами и в соединении этого комплекса антиген-антитело с иммуноглобулинами, содержащим ферментную метку. Иммуноглобулины, применяемые в таких тест-системах, так называемый конъюгат, может быть получен на основе антивидовых антител (например кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (M, G, А). В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определенного класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M). ИФА применяют для диагностики таких заболеваний как: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции. Иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счет антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приеме лекарственных препаратов; у новорожденных ложноположительные реакции могут возникать за счет образования в организме ребенка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции. В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на:

• лизатные - в которых используется нативный антиген (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

• рекомбинантные - в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;

• пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Иммуноферментный анализ: удобство в работе, быстрота, объективность за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) - в настоящее время этот метод является одним из основных в лабораторной диагностике.

Радиоиммунологический анализ (РИА) является наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченого радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде. РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом.

В последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемым моноклоном, т.е. культурой клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген.

К числу наиболее чувствительных и высокоспецифичных иммунологических методов обнаружения антигенов относится метод полимеразной цепной реакции, который позволяет обнаруживать в исследуемом материале присутствие нескольких молекул искомого антигена или единичных возбудителей. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией) ПЦР позволяет осуществлять множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК). Различные варианты метода ПЦР нашли широкое применение в клинической иммунологии при: выявлении в клинических образцах микроорганизмов (вирусов, бактерий, простейших, грибов и др); обнаружение генетически-опосредованных иммунопатологий; типирование генов HLA при трансплантации органов и тканей, оценке связи с заболеваниями; определение экспрессии генов и полиморфизмов иммунологически важных молекул (цитокины и их рецепторы, сигнальные молекулы и др). Преимущества ПЦР как метода диагностики:

• Универсальность. Метод позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

• Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

• Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце.

• Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

• Возможность доклинической и ретроспективной диагностики ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. в серонегативной фазе, или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

• Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

• Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

• Возможность экспертизы - полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб, неверная диагностическая стратегия врача, использующего ПЦР-диагностику, случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований (например с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА), возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела, при хронических инфекциях, которые сопровождаются иммунодепрессией.

ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА

Иммунный статус - комплекс количественных и функциональных показателей, отражающих конкретное состояние иммунной системы, определяемой с помощью стандартных общепринятых доступных тестов, которые позволяют получить ориентировочные сведения об общих параметрах иммунной системы. Наряду с другими сведениями данные о состоянии здоровья индивида могут служить одним из показателей качества жизни.

Подходы к оценке иммунного статуса: тесты 1 и 2 уровня.На первом этапе выявляют общие дефекты клеточного и гуморального звена адаптивного (субпопуляции лимфоцитов, изотипы иммуноглобулинов и др.) и врожденного иммунитета (активность фагоцитов и компонентов комплемента). Для этого используют простые ориентирующие тесты. Минимальный набор таких тестов включает определение: относительного и абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови (общепринятый анализ крови);относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток с использованием моноклональных антител против CD3-, CD19- и CD16\CD56- маркеров соответственно; субпопуляции Т-лимфоцитов: Т-хелперов (CD3+, CD4+) и ЦТЛ (CD3+CD8+) и их соотношения (CD4\CD8); концентрации сывороточных иммуноглобулинов основных классов (IgM, IgG, IgA); фагоцитарной активности лейкоцитов, выработки активных форм кислорода; активности комплемента; возможен анализ других показателей (например, цитокинов). Если выявлены отклонения показателей в ориентирующих тестах или при специальных показаниях, рекомендуется более тщательно анализировать иммунный статус. На втором этапе использование аналитических тестов позволяет выявить более тонкие и конкретные дефекты в иммунной системе. Комплекс тестов второго уровня может варьироваться в зависимости от поставленных врачом задач. Требования к тестам: стандартизация, воспроизводимость, информативность, высокая квалификация персонала лаборатории, тест должен отражать конкретный показатель или процесс в иммунной системе. На втором этапе в зависимости от конкретных задач определяют: количество субпопуляции Т-лимфоцитов: Th1-, Th2-, TH17-лимфоциты, естественные (Treg) и индуцированные (Tr1, Th3) регуляторные Т-клетки, NKT- лимфоциты и др); фенотипические характеристики клеток иммунной системы на разных этапах иммуногенеза и иммунопоэза (в онкогематологии определение малигнизированных лимфоцитов); экспрессию активационных маркеров: CD25, CD69, CD71, HLA-DR и др.; пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки; активационный апатоз в культуре лимфоцитов in vitro; количество и функцию Th1-, Th2- лимфоцитов и регуляторных Т-клеток по внутриклеточному содержанию и выработке типичных цитокинов (ИФН, ИЛ4, ТФР-В); активность киллерных лимфоцитов (ЦТЛ, NK-клеток и др.) с определением гранзимов/перфорина и осуществлением апатоза через Fas\FasL; классы и подклассы сывороточных, секреторных и других иммуноглобулинов; антитела разной специфичности, в том числе и аутоантитела, иммунные комплексы, патологические иммуноглобулины; синтез иммуноглобулинов в культуре В-лимфоцитов in vitro; наиболее типичные цитокины в сыворотке крови и различных биологических жидкостях; различные этапы фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов; подавление миграции моноцитов in vitro в присутствии митогена или специфического для Т-лимфоцитов антигена; функцию рецепторного врожденного иммунитета (TLR и др.); содержание различных компонентов комплемента; результаты (при отсутствии противопоказаний) кожных тестов ГЗТ на туберкулин, антигены грибов, аллергены. Следует иметь ввиду, что показатели иммунного статуса могут существенно варьировать в зависимости от многих факторов даже в норме (например, в зависимости от биологических циклов, гормональных и экзогенных воздействий). Именно поэтому понятие «нормальный иммунный статус» условно. Определение параметров иммунной системы при различных патологических состояниях дает возможность подразделить на три главные группы: без существенных изменений иммунного статуса; с недостаточностью иммунной системы (иммунодефициты); с повышенной активацией иммунокомпетентных клеток (аутоиммунные заболевания, аллергия, воспаление). Абсолютные показатели иммунного статуса более информативные, чем относительные (процентные).

Патогенетический принцип оценки функций иммунной системыоснован на лабораторной оценке ключевых этапов иммунного ответа, позволяющий установить уровень патогенетического дефекта в иммунной системе. Оценивают стадии развития иммунного процесса, включая, распознавание, активацию, пролиферацию, дифференцировку, эффекторные механизмы, формирование иммунной памяти, регуляцию и апоптоз на всех этапах иммунного ответа. Одни из постулатов патогенетического подхода – при блоке предыдущего этапа последующий несостоятелен, и нужно искать подходы, чтобы снять этот блок. Тесты для оценки процессов распознования: смешанная культура лимфоцитов; взаимодействие лимфоцита смакрофагами, предварительно обработанными антигеном в системе in vitro; определение экспрессии молекул МНС класса 2 (презентация антигена); оценка образования цитокинов (ИФН, ИЛ; и др.) Т-клетками при распознавании специфического антигена; выявление специфических CD4 и CD8 Т-лимфоцитов с использованием комплексов рекомбинантных молекул, обозначенных как тетрамеры, каждый из которых состоит из молекулы МНС класса 1 или 2, нагруженной антигенными пептидом, и метки. Для оценки активации лимфоцитов определяют: экспрессию лимфоцитами и другими клетками иммунной системы маркеров активации: СD25, CD69, CD71, HLA-DR и др.; внутриклеточные сигнальные молекулы лимфоцитов, в том числе внутриклеточную концентрацию ионов Са2+, экспрессию генов тирозинкиназ, протеинкиназу С, ядерные факторы транскрипции; активность НАДФН-оксидазы в нейтрофилах и моноцитах; выработку провоспалительных цитокинов с участием рецепторов врожденного иммунитета (TLК и др.). Если активация лимфоцитов блокируется до вступления в пролиферацию, то клетки подвергаются апоптозу и погибают (феномен апоптоза индуцированного активацией- концепция апоптогенных иммунодефицитов). Усиленная активация иммунной системы становится одной из важнейших в патогенезе многих заболеваний человека, включая ВИЧ-инфекцию, воспалительные процессы и др. Следствие приобретенной гиперактивации иммунной системы - иммунодефицит. Для исследование иммунопролиферативной активности иммунокомпетентных клеток используют тесты на определение: пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на митогены: фитогемагглютинин и конканалин А ( по пролиферативному ответу судят о функции Т-клеток), ЛПС (функции В-клеток, а настимуляцию митогеном лаконоса – о взаимодействии между Т- и В- клетками); пролиферативного ответа лимфоцитов на специфические антигены и аллергены. Для оценки эффекторных функций иммунокомпетентных клеток используют тесты: клеточную цитотоксичность (Т-киллеры, NK-клетки и др.; образование иммуноглобулинов в культуре В-лимфоцитов in vitro; образование клетками иммунной системы иммуноцитокинов и ответ на них in vitro. Цитотоксические тесты проводят, чтобы оценить способность Т-киллеров, NK-клеток, макрофагов убивать клетки мишени in vitro. Главные методы оценки функциональной активности В-лимфоцитов – определение синтеза иммуноглобулинов в культуре антителообразующих клеток in vitro, а также в сыворотке – главные методы оценки функциональной активности В-лимфоцитов. Важное значение имеет оценка регуляторного звена: соотношение числа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов; соотношения про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке и различных биологических жидкостях; количество регуляторных Т-клеток фенотипа CD4+ CD25 FoxP3+ и их функциональных свойств при совместном культивировании с клетками-мишенями in vitro. Соотношение числа СD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови называют иммунорегуляторным индексом (норма 1,6-2,2). Если этот показатель изменяется в сторону снижения - это характерно для приобретенных форм иммунодефицита (прогрессирующей ВИЧ- инфекии). Если изменяется в сторону повышения - аутоиммунные и другие иммунопатологии. Регуляторные функции клеток врожденного иммунитета (моноцитов/ макрофагов, нейтрофилов и др.) оценивается в тестах на образование цитокинов, презентацию антигена и др. Этиологический принцип оценки иммунной системы, заключается в подборе определенных методов исследования, которые позволяют получить максимум информации о данной патологии исходя из этиологического фактора иммунопатологии. Например, при вирусной инфекции это оценка интерферонов и определение их уровня в сыворотке, исследование способности мононуклеарных клеток продуцировать интерфероны; исследование цитотоксических клеток, включая определение их количества и функциональной активности; определение цитокинов. Играющие важную роль в противовирусной защите. Третий принцип оценки иммунной системы – аналитический, основанный на комплексной оценке различных иммунных подсистем, например, цитокиновой, рецепторов врожденного иммунитета, комплемента и т.д. Комплексный анализ системы цитокинов включает несколько последовательных этапов: анализ на уровне клеток продуцентов (мононуклеарные клетки, лимфоциты, лейкоциты, макрофаги, ДК и др.) – генный и клеточный уровень; анализ растворимых цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма; определение действия цитокинов на клетки-мишени. Аналитический подход дает возможность выявлять дефект на разных уровнях функционирования не только цитокинов, но и системы рецепторов врожденного иммунитета (например, TLR), антителогенеза.

ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский

университет им. Н. И.Пирогова

Минздрава России

Реферат

На тему: «Иммунодиагностика. Оценка иммунного статуса человека».

Предмет: Иммунология

выполнила студентка

466 группы

Московского факультета

Анурова Н. И.

Москва

2014г.