Реакция Нейтрализации на мышах с целью идентификации вируса клещевого энцефалита

Вирус КЭ патогенен для ряда лабораторных и диких животных. Наибольшей чувствительностью обладают новорожденные и молодые белые мыши. После заражения в мозг, интраперитонеально, внутримышечно у этих животных развивается энцефалит, заканчивающийся гибелью животных. Из сельскохозяйственных животных наиболее восприимчивы к вирусу КЭ козы, менее восприимчивы овцы и коровы, и слабо восприимчивы лошади. Вирус КЭ обладает цитопатогенным действием (ЦПД), вызывая цитопатические изменения в первичных и перевиваемых культурах клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ и ПЭС) и размножается без выраженного ЦПД во многих других клеточных культурах. В мозге инфицированных мышей и культуральной жидкости зараженных культур происходит накопление вируса КЭ и специфических вирусных антигенов: комплементсвязывающих, гемагглютинирующих, преципитирующих и др.

Вирус КЭ длительное время сохраняется при низких температурах (оптимальный режим -60 град. С и ниже), хорошо переносит лиофилизацию, в высушенном состоянии сохраняется много лет, но быстро инактивируется при комнатной температуре. Кипячение убивает его через 2 минуты, а в горячем молоке при 60 град. С погибает через 20 минут.

Инактивирующим действием обладают также формалин, фенол, спирт и другие дезинфицирующие вещества, ультрафиолетовое излучение.

Реакция нейтрализации основана на способности специфических иммунных сывороток гасить инфекционное действие вирусов. Применяется в двух направлениях:

1) для типирования выделенных вирусов;

2) для титрования антител в сыворотках переболевших.

Постановка реакции:

1. На лабораторных животных. Критерием наличия вируса

служит гибель лабораторных животных. Высчитывается LD50

- предельное разведение вирусной суспензии, которое

вызывало гибель 50% зараженных животных. Для

идентификации вируса клещевого энцефалита проводят

внутримозговое заражение белых мышей.

2. В тканевых культурах. Учет результатов проводят

- по цитопатическому действию (ЦПД)

- по методу цветной пробы, основанной на изменении цвета

индикатора среды в результате дегенерации клеток;

- по гемадсорбции.

3. В Курином эмбрионе. Учет результатов проводится по

появлению оспин по хорионаллантоисной оболочке.

РТГА

Эта реакция применяется в вирусологической практике:

- для определения типа вируса (на стекле);

- для обнаружения в сыворотке больных (развернутая).

При постановке ориентировочной реакции торможения гемагглютинации на стекло наносят по 1 капле типоспецифических иммунных сывороток, затем добавляют по 1 капле испытуемого материала и 1 капле 5% взвеси эритроцитов.

Учет результатов: тип вируса определяют по той сыворотке, с которой реакция не произошла, так как иммунная сыворотка, специфическая для выделенного вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность, и эритроциты не агглютинируются.

ИФА

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидаза является раствор ортофенилдиамина.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. Сущность ИФА аналогична РИА.

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

- простота методов оценки реакции;

- стабильность конъюгатов;

- легко поддаётся автоматизации.

Однако, по сравнению с РИА, отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

Конкурентный тип.

Назначение.

Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.

Компоненты:

1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;

2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;

3) коньюгат — мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,

4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

— положительная (сыворотка с НВе Ад);

— отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2) Инкубация 1 час при 37 «С.

3) Отмывание лунок.

4) Внесение конъюгата.

5) Инкубация 1 час при 37 «С.

6) Отмывание лунок.

7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.

Механизм

Реакция протекает в три фазы:

1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад — агл\ НВз АТ).

2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).

3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.

Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции — обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:

1) исследуемый материал — сыворотка крови;

2) синтетические пептиды, имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: др 120 и др 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТкАТ-м);

4) ОФД;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

- положительная;

- отрицательная.

Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток. 2} Инкубация 30 минут при 37 «С.

3) Отмывание.

4) Внесение антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом.

5) Инкубация 30 минут при 37 «С.

6) Отмывание.

7) Внесение ОФД. Механизм

Реакция протекает в 3 фазы:

1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (др 120 и др 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ {АТ к ВИЧ — АГ ВИЧ).

2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

Учет реакции ИФА

При ИФА в качестве метки применяют ферменты. Используется в диагностике СПИДа и вирусных гепатитов. Иммуноферментная система «Гепа Стрип» предназначена для выявления поверхностного HbsAg антигена вируса гепатита В.

Компоненты:

1. Полистироловый планшет;

2. Антитела к HbsAg;

3. Конъюгат - мышиные моноклониальные антитела, меченые

пероксидазой;

4. Контрольные сыворотки;

5. Фосфатно-солевой буфер;

6. Ортофенилдиамин (ОФД).

Реакция протекает в две фазы. HbsAg связывается с гомологичными антителами, меченными пероксидазой. Затем ставят цветную реакцию с использованием ОФД, происходит желтое окрашивание.

Учет ИФА - по оптической плотности с помощью фотометра, при этом степень оптической плотности будет обратно пропорциональна концентрации HbsAg антигена вируса гепатита В.

РИФ

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:

1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);

2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;

3) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.

Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.

Компоненты непрямой РИФ:

1) исследуемый материал;

2) специфическая антисыворотка;

3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;

4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.

Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.

Реакция относится к серологическим реакциям с участием меченых антигенов или антител.

Проводится прямым и непрямым методами.

При прямом методе обнаруживают антиген в материале от больного. Используется диагностическая флюоресцирующая сыворотка, которая содержит иммуноглобулины, выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами.

Специфический антиген обнаруживается в виде ярко-зеленых люминесцирующих конгломератов, а фон препарата окрашивается в оранжево-красный цвет.

Компоненты реакции прямой иммунофлюоресценции:

Для поиска антигена при экспресс-диагностике:

1) исследуемый материал;

2) специфическая люминесцентная сыворотка;

3) люминесцентный микроскоп.

При диагностике гриппа проводят дифференциацию от возбудителей парагриппа и аденовирусной инфекции. Носоглоточный мазок обрабатывают флюоресцирующей гриппозной сывороткой или гриппозным иммуноглобулином.

«+» результат в виде зеленого свечения получают через 3 часа.

При непрямом методе проводят обнаружение и титрование специфических антител. Титром сыворотки называется ее максимальное разведение, при котором отмечается флюоресценция на «+ +».

Компоненты реакции непрямой иммунофлюоресценции

Для поиска антигена при экспресс-диагностике:

1) исследуемый материал (антиген);

2) специфическая сыворотка;

3) антиглобулиновая люминесцентная сыворотка

4) люминесцентный микроскоп.

/ фаза специфическая

Сывороточные антитела адсорбируются на антигене.

// фаза неспецифическая

Используется антиглобулиновая сыворотка с антителами, меченными флюорохромами. Образуется комплекс антиген+антитело (I) + антиглобулиновая сыворотка (II), который светится.

37)Серологическая диагностика Вич,с помощью реакции иммуноблотинга

По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА . Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.

Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий ( рис. 27 ). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки ( gp160 , gp120 , gp41 ) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.

Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и "промокают" (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из гела на мембрану. В результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала, добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса антиген - антитело - меченый коньюгат определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления все становится ясным, есть антигены в крови или их нет.