Методические указания к практической работе по УИРС

1. Изучение носительства патогенного стафилококка бактериологическим методом.

1 день исследования

Материалом для исследования служит слизь из передних отделов носа. Слизь из зева исследуют по показаниям и, прежде всего, при наличии воспалительного процесса там. Материал забирают одним стерильным тампоном из обеих половинок носа, лучше всего натощак, или не ранее, чем через 2–3часа после приема пищи.

Первичный посев производят на ЖСА или желточно-молочно-солевой агар сразу или не позднее, чем через 2 часа после его забора. Посев производят тампоном, втирая материал в среду и многократно поворачивая его, чтобы перенести на среду максимальное количество взятого материала. Для количественного определения массивности обсеменения верхних дыхательных путей, тампон помещают в пробирку с 0,5 мл стерильного физиологического раствора, ополаскивают его, встряхивают 10 минут, отжимают о стенки пробирки, удаляют. Содержимое пробирки многократно перемешивают пипеткой. Другой пипеткой берут 0,1 мл смыва и наносят на поверхность ЖСА, тщательно растирают шпателем и помещают в термостат при температуре 37 градусов на 2 суток.

2–3 день исследования

Изучают посевы, отмечая характер роста и массивность обсеменения.

а) определение массивности обсеменения

Для определения обсемененности подсчитывают общее число выросших колоний, отдельно колонии различной морфологии и число колоний, в которых культуры обладают лецитиназной активностью, после чего производят расчет на весь объем смыва.

Если массивность обсеменения выражают показателем десять во второй степени и более, то это показатель умеренного обсеменения. При таком показателе выделение возбудителя во внешнюю среду, как правило, не имеет места.

Если обсемененность выражается показателем десять в третьей степени и более микробных клеток, снимаемых на тампон, то это является показателем высокой обсемененности, при которой происходит выделение возбудителя во внешнюю среду, как при кашле и чихании, так и при спокойном дыхании.

Если количественное определение обсемененности не проводилось, то массивность обсеменения определяют ориентировочно по характеру роста на ЖСА, обозначая в плюсах:

++++ – сливной рост

+++ – сплошной рост изолированных колоний

++ – значительный рост (до 100 колоний)

+ – единичные колонии (10–25)

Сливной и сплошной рост соответствует, как правило, массивности обсеменения десять в третьей степени и выше микробных клеток, снимаемых на тампон.

б) изучение характера роста на ЖСА

Просматривают чашки с ЖСА, обращая внимание на круглые блестящие, маслянистые выпуклые пигментированные колонии с радужным венчиком и помутнением среды вокруг. Эти колонии подозрительны на колонии лецитиназоположительных стафилококков. Для дальнейшего исследования отбирают не менее 2-х колоний с лецитовителлазной реакцией. Их отсевают на скошенный агар. Если такие колонии на ЖСА отсутствуют, то дальнейшему исследованию подлежат пигментированные колонии, подозрительные на колонии стафилококка. Если вырастают колонии, различающиеся по пигменту, следует отобрать не менее 2-х колоний каждого вида. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18–20 часов при температуре 37 градусов.

4 день исследования

Изучение чистой культуры и ее идентификация

а) изучение чистой культуры

Описывают характер роста на скошенном агаре, который в ряде случаев позволяет предположить принадлежность культуры к виду St.aureus или St.epidermidis, так как St.aureus дает на скошенном агаре обильный, равномерный, сочный рост, в то время как St.epidermidis растет скудно и неравномерно по ходу посева.

Далее выделенную культуру изучают в мазке, окрашенном по Граму для проверки морфологии и тинкториальных свойств. Окраску по Граму производят общепринятым методом. Под микроскопом видны грамположительные кокки, располагающиеся гроздьями или небольшими кучками, в виде кружев. У выделенной культуры изучают наличие коагулазы.

б) определение плазмокоагулирующей активности

Постановка реакции основана на способности стафилококковой коагулазы, активировать естественное свертывание плазмы. Свежеполученную или сухую плазму кролика разводят физиологическим раствором 1:5 и разливают по 0,5 мл в пробирки. Человеческая плазма менее пригодна, так как в ней могут содержаться антитела, нейтрализующие стафилококковую коагулазу, но если нет кроличьей плазмы, то используют человеческую, также разводя ее. В пробирки, содержащие 0,5 мл плазмы, вносят по 1 петле агаровой суточной культуры стафилококка. Посевы вместе с контрольными пробирками помещают в термостат при температуре 37 градусов на 3 часа, учитывают предварительный результат и оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре, после чего учитывают окончательный результат.

Реакцию считают положительной независимо от степени свертывания плазмы: от небольшого сгустка, взвешенного в плазме, до полного неподвижного сгустка плазмы. Оставлять реакцию в термостате более 3 часов не рекомендуется, так как может проявиться действие фибринолизина и сгусток расплавится. По результатам плазмокоагуляции и лецитиназной активности планируют дальнейшие исследования.

1. Если выделенная культура обладает плазмокоагулазой и лецитовителлазой, то следует выдать ответ о принадлежности ее к St.aureus без проведения дополнительных исследований.

2. Если выделенная культура обладает только коагулазой или только лецитиназой, то следует определить другие признаки патогенности: ДНК-азную активность, продукцию гемолизина, а также изучить ферментацию маннита.

а) определение ДНК-азной активности

Метод основан на способности ДНК-азы разрушать высокополимерную ДНК на низкополимерные фрагменты. Для постановки этой пробы используют среду с ДНК, на которую засевают суточную испытуемую культуру. После инкубирования при температуре 37 градусов в течение 18–24 часов, посев обрабатывают соляной кислотой и учитывают результат. При положительной реакции наблюдают появление вокруг посева культуры прозрачной зоны, превосходящей ширину штриха в 4 и более раз. Если проба на ДНК-азу будет положительной, то культуру относят к St.aureus.

б) определение гемолитической активности

Гемолитической активностью обладают не только патогенные стафилококки, но в 60–70% эпидермальные, поэтому этот тест не имеет диагностического значения. Его используют для определения альфа-токсина у выделенной культуры стафилококков. Для определения альфа-токсина следует использовать 5% кровяной агар, содержащий эритроциты кролика. Испытуемую культуру засевают бляшками на поверхность агара, инкубируют при температуре 37 градусов 18–20 часов. При наличии альфа-токсина вокруг макроколоний стафилококка видна прозрачная зона гемолиза.

в) определение анаэробной ферментации маннита

Для постановки теста следует использовать среду, содержащую маннит и индикатор, разлитую в пробирки. После регенерации среду заливают слоем стерильного вазелинового масла. Испытуемую культуру засевают уколом. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 градусов в течение 5 дней. В случае ферментации маннита среда изменит цвет по всему столбику агара. Определение антибиограммы проводят по показаниям только после выделения и идентификации чистой культуры. Выделенные культуры золотистого стафилококка фаготипируют. Обязательно типируют патогенные стафилококки, выделенные со слизистой носа у персонала родильных домов. Культуры, выделенные от больных, типируют по эпидпоказаниям.

Для типирования используют Международный набор, состоящий из 22 фагов, которые разделены на фагогруппы.

3. Если выделенная от носителей культура не обладает лецитиназной и коагулазной активностью, то проводят первичную идентификацию ее для установления принадлежности к семейству микрококков и роду стафилококков.

а) для установления принадлежности к семейству микрококков изучают наличие каталазы.

Для постановки этого теста на выросшую колонию следует нанести каплю 3% раствора перекиси водорода. Если каталаза положительна, то немедленно после нанесения реактива наблюдают выделение пузырьков газа. У представителей семейства микрококков проба на каталазу положительная.

б) установление отношения к роду Staphylococcus

На этом этапе проводят исследования, которые позволяют отличить стафилококки от микрококков. Для этого изучают характер образуемого пигмента, а также способность ферментировать глюкозу. Стафилококки являются факультативными анаэробами, они ферментируют глюкозу и растут в анаэробных условиях. Микрококки – облигатные аэробы, они глюкозу окисляют и в анаэробных условиях не растут. Для постановки этой пробы используют полужидкие среды, содержащие 1% глюкозы и индикатор. Перед посевом среду регенерируют, быстро охлаждают. Культуру засевают уколом, а затем сверху заливают слоем стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при температуре 37 градусов в течение 5 суток. Положительной считают реакцию, если изменение цвета индикатора занимает не менее 2/3 высоты столбика.

в) видовая идентификация стафилококков

На этом этапе проводят исследования для определения принадлежности культуры к видам St.epidermidis и St.saprophyticus. Для установления видовой принадлежности у выделенных культур определяют наличие фосфатазы, способность окислять маннит и чувствительность к новобиоцину. Антибиотик новобиоцин в определенной концентрации способен подавлять рост St.epidermidis, но не влияет на рост естественно резистентных к нему St.saprophyticus. Для постановки этого теста готовят чашки с МПА, содержащим 2 мкг/мл новобиоцина. На поверхность среды засевают культуру в виде бляшек. Если после суточного инкубирования культура вырастает на среде с новобиоцином в виде крупной бляшки, значит она к нему устойчива. Если же роста нет или вырастает небольшое число мелких колоний, то культуру считают чувствительной.

Определение фосфатазы основано на способности этого фермента, отщеплять фосфатную группу от фосфаторганического соединения. Для постановки этого теста выделенные культуры засевают на специальную среду, содержащую фенолфталеинфосфат. После инкубации выросшую культуру подвергают воздействию паров аммиака, затем учитывают результат. При наличии фосфатазы макроколонии окрашиваются в розовый цвет.

Определение окисления маннита проводят путем посева на полужидкую среду Хью-Лейфсона, содержащую 1% маннита и индикатор. Суточную культуру засевают уколом, инкубируют при температуре 37 градусов 18–20 часов. При окислении маннита среда с поверхности желтеет.

4–5 день исследования

Учет и интерпретация полученных результатов

1. Установление рода.

По совокупности полученных данных и определяют вид выделенной культуры.

Таблица 26