Кожно – аллергический метод.

Тема 2.14.2: «Микозы, вызываемые условно – патогенными грибами».

План

1. Микозы, вызываемые условно – патогенными грибами (аспергиллы, кандида, пневмоциста).

Вторичные микозы.

Грибы, которые обычно не вызывают заболевания у здоровых людей, могут приводить к его развитию у лиц с нарушенными защитными механизмами. Такие условно – патогенные (оппортунистические, потенциально – патогенные) грибы могут поражать любые органы человека. Только некоторые условно – патогенные грибы или актиномицеты могут вызвать развитие заболевания при соответствующих предрасполагающих состояниях. Нередко при значительных нарушениях механизмов защиты возбудителями вторичных микозов одновременно являются несколько видов грибов.

Инфекции, вызванные грибами рода Candida и другими дрожжевыми грибами, развиваются как эндогенные заболевания. Конидии других грибов обычно обнаруживают в воздухе. Другими условно – патогенными грибами являются грибы родов Fusarium, Penicillium ,Geotrichum, Paecilomyces, Scopulariopsis, также многие «черные плесени».

Чаще других микозы у человека вызывают следующие условно – патогенные грибы: аспергиллы, кандида, фикомицеты, пневмоциста.

Аспергиллы.

Таксономия.

Род Aspergillus («лейчатый») включает около 200 видов плесневых грибов. Относится к классу Ascomycetes. Для человека патогенны 20 видов аспергилл, из них чаще всего аспергиллез человека вызывают три: A.fumigatus , A.flavus, A.niger.

Морфология.

Все аспергиллы в тканях, экссудатах и мокроте имеют вид септированных нитей, которые характеризуются дихотомическим ветвлением. Все они имеют многоклеточный септированный мицелий с одноклеточными булавовидными конидиеносцами, от которых в виде струек воды из лейки отходят конидии (расходящиеся радиально) характерные цепочки конидий, см. рис. 25.9). Культуры на агаре Сабуро при температуре 37 – 40⁰ С растут в виде колоний с центральным куполообразным возвышением (конидиеносцы):

· A. fumigatus – сине – зеленые зернистые или пушистые колонии, окаймленные белой зоной;

· A. flavus - желтые или грязновато – желтые пушистые колонии;

· A. niger – постепенно чернеющие пушистые колонии.

Эпидемиология и клиника.

Если давать широкое определение инфекции, то аспергиллезами следует называть микозы, имеющие различные причины и патогенез. Плесневые грибы Aspergillus fumigates распространены в природе очень широко (на разрушающихся растительных субстратах на почве). Они могут инфицировать и затем инвазировать ткани травматизированной роговой оболочки глаза, обожженные и раневые поверхности, а также наружное ухо (наружный отит). У больных с иммунологическим дефицитом или у людей с анатомическими нарушениями со стороны дыхательной системы аспергиллы могут стать причиной вторичных микозов (легочной аспергиллез). Многие виды аспергиллов продуцируют афлатоксины в пищевых продуктах.

Зараженные аспергиллезом при ингаляции конидий аспергилл или они проникают в организм через поврежденную кожу. Здоровые люди абсолютно резистентны к аспергиллам.

Легочной аспергиллез может проявляться различными клиническими формами инфекции. Одна из них – «грибковый шар» развивающийся в ранее существующей полости (например, в туберкулезной каверне, бронхоэктазах); при этой форме аспергиллы не инвазируют ткани. Таким больным обычно требуется только лечение основного заболевания. У них могут наблюдаться высокие титры Ат к антигенам аспергиллов.

Вторичная форма – это активная инвазивная аспергиллезная гранулема (аспергиллома), распространяющаяся в легочной ткани и приводящая к развитию некротизирующей пневмонии или кровохарканья, а также характеризующаяся вторичной диссеминацией процесса в другие органы. Эта форма болезни наблюдается главным образом у больных с иммунологическим дефицитом или на фоне лечения иммунодепрессантами; при ней требуется активное противогрибковое лечение фторцитозином и амфотерицином В.

Третья форма – это аллергический легочной аспергиллез с астмой , эозинофилией, высокими титрами сывороточных IgE и минимальной инвазией тканей; в то же время при бронхографии выявляют значительные отклонения от нормы.

При диссеминированном аспергиллезе поражаются различные внутренние органы. Аспергиллы распространяются в них диффузно, и заболевание всегда заканчивается смертельным исходом.

Лабораторная диагностика.

Убедительным основанием для установления диагноза аспергиллеза являются обнаружение фрагментов мицелия в биопсийныхх тканях и патологическом материале при окраске метенамином и солями серебра.

Диагноз аспергиллеза подтверждается и получением чистых культур. Экстракты из культур используют в качестве антигенов, для постановки серологических реакций, в особенности для реакции иммунодиффузии и иммунофлюоресценции.

Морфолого- культуральные исследования при аспергиллезе можно дополнить кожными аллергическими пробами.

Лечение.

Аспергиллез лечится с большим трудом. Используют амфотерицин В, амфоглюкамин, интраконазол.

Аспергилломы удаляют хирургическим путем.

Кандида.

Таксономия.

Дрожжеподобные грибы рода Candida относятся к семейству криптококковых , классу Blastomycetes. Род Candida включает 81 вид, среди которых преобладающее значение в патологии человека принадлежит Candida albicans.Этот вид является доминирующим, но не единственным этиологическим фактором кандидоза: от больных выделяют C.tropicalis, C.pseudotropicales, C. krusei, C. parapsilosi, C.guilliermondi.

Грибы рода Candida – это одноклеточные микроорганизмы круглой или вальной формы(4-8 мкм в диаметре), размножающиеся почкованием. Молодая почка, или клетка, называется бластоспорой. Родовым признаком Candida являются способность формирования нитчатой формы в виде псевдомицелия. Псевдомицелий состоит из отдельных клеток, каждая из которых имеет свою оболочку в отличие от истинного мицелия, также состоящего из отдельных клеток, но имеющего одну оболочку.

В препаратах, приготовленных из экссудатов, грибы рода Candida видны как грамположительные овальные почкующиеся дрожжевые клетки размером 2-3 Х 4-6 мкм, а также как грамположительные удлиненные почкующиеся клетки. Похожие на гифы мицелия (псевдомицелий, рис. 25.20).

Дрожжеподобные грибы рода Candida – аэробы, хорошо растут на питательных средах: СПА, с сывороткой и кровяной агары. Среда Сабуро с глюкозой, сусло – агар. Ph среды 6,0 - 6,5. Оптимальная температура роста 30 – 37⁰С.

Колонии на средах крупные, круглые, выпуклые, края ровные, поверхность гладкая, блестящая.

В жидкой среде имеют вид пленок различной толщины и плотности, пристеночных колец различного размера; рыхлого или зернистого осадка, реже слизистого.

C. albicans на среде Сабуро при комнатной температуре образуют мягкие кремовые, кремовато – беловатые , гладкие, выпуклые колонии, имеющие запах дрожжей; а на жидких - рыхлый осадок на дне, легкое помутнение.

C. albicans ферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты и газа; сахарозу ферментируют до кислоты, а лактозу не ферментируют .

Биохимическую активность у грибов Candida изучают на среде Гисса с реактивом Андреде. Слабощелочная пептонная среда разливается по стерильным пробиркам с поплавками (трубочки – поплавки опускают отверстием вниз и они должны быть полностью заполнены питательной средой). Засевают пробирки суточной агаровой культурой, внося ее обычной петлей или пастеровской пипеткой из взвеси в ИХН. Посевы выдерживают в течение 15 суток в термостате, наблюдение за ростом и образованием КГ проводят каждые 5 дней. При разложении углеводов и связанная с этим подкислением среды бесцветная пептонная вода становится красной.

Эпидемиология и клиника.

Грибы рода Candida широко распространены во внешней среде (в молочных продуктах, фруктах, других пищевых продуктах, на предметах обихода, игрушках, в воздухе и др.), в которых при наличии благоприятных условий могут размножаться.

Candida – факультативные паразиты кожи и слизистых оболочек человека и животных. Они представляют собой нормальную микрофлору слизистых оболочек респираторного и желудочно-кишечного тракта, а также женской половой сферы. В этих системах они могут находится в большом количестве и вызывать развитие патологических состояний.

Кандидоз – антропонозные и эндогенные заболевания, возникающие при дисбактериозах и иммунодефицитах, вызванных длительным применением антибиотиков широкого спектра действия и иммунодепрессантов.

Основным фактором, предрасполагающим к развитию кандидозных поражений, являются сахарный диабет, общее истощение макроорганизма, прием иммунодепрессантов, постоянные внутривенные катетеры и катетеры для отвода мочи, применение кортикостероидных гормонов, противомикробных препаратов (которые изменяют состав нормальной микрофлоры), внутривенное введение больших количеств наркотиков.

Кандидоз – самая распространенная оппортунистическая инфекция. Выделяют:

· локальные кандидозы (кожных покровов), кожи ногтевых валиков и ногтей, слизистых оболочек полостей рта, глотки, вагины, вульвы);

· системные кандидозы (дыхательных путей, кишечника, мочеполовой системы, ЦНС);

· генерализованные кандизозы (септикопиемия, хронический гранулематозный кандидоз).

Лабораторная диагностика.

Полиморфизм клинических проявлений заболевания обуславливает разнообразие патологического материала, подлежащего исследованию. Для исследования с соблюдением всех правил забирают при локальных и системных формах субстрат из пораженного места (кожные и ногтевые чешуйки, соскобы с ногтей, гной, мокрота, кал, моча, желчь, ликвор, белковые налеты и обрывки эпителия с пораженных участков красной каймы губ, слизистой рта, наружных половых органов, стенок влагалища, соскобы со слизистой уретры или отделяемого уретры, отделяемое свищей), при генерализованных формах – кровь, биопсированный секционный материал.

Микробиологический диагноз кандидоза состоит в микроскопии патологического материала и выделении у него культуры кандид.

Микроскопический метод.

Патологический материал исследуется в неокрашенных и окрашенных препаратах. Для их приготовления нужны чистые, тонкие предметные и покровные стекла, предварительно хорошо обезжиренные кипячением в мыльных растворах или соде и сохраненных в смеси этилового спирта с эфиром (смесь Никифорова). Исследования проводят в капле водопроводной воды или 5-10% - ного раствора едких щелочей, раствора Люголя. Раствор добавляется в равном объеме к гомогенной взвеси патологического материала на стекле, покрывается покровным стеклом и через 3-5 минут препарат исследуется под микроскопом. В положительных случаях на фоне тонких пластов рыхлого эпителия видны круглые или овальные почкующиеся дрожжеподобные клетки. Наряду с ними постоянно встречаются удлиненные элементы псевдомицелия.

Для приготовления окрашенных препаратов на стекле готовят тонкие штриховые мазки, подсушивают на воздухе, фиксируют этиловым спиртом или смесью Никифорова в течение 10- 15 минут. Препараты окрашивают по Граму обычным методом и микроскопируют . Окрашенные клетки дрожжеподобных грибов представляются темно – фиолетовыми или неравномерно окрашенными.

Бактериологический метод.

Схема исследования:

I этап – исследуемый материал помещают в пробирку с 5 мл жидкого сусло и инкубируют при температуре 37⁰ С в термостате, через 2-3 дня производят высев 0,1 мл на агар Сабуро, тщательно рассеивая материал шпателем круговыми движениями по всей поверхности среды.

I I этап – через 2-3 дня при наличии роста колоний (непрозрачная в проходящем свете, белового или кремового цвета, с гладкой блестящей поверхностью, маслянистой консистенции) делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют . Если в мазках обнаружены дрожжевые клетки, то:

1. Делают отсев нескольких колоний на среду Сабуро в пробирки для выделения чистой культуры гриба.

2. Несколько колоний засевают на картофельный агар для дифференциации истинных дрожжей от дрожжеподобных грибов рода Candida. Посев делается в виде параллельных штрихов на чашку с агаром (лучше сеять лопаточкой, прорезая агар до дна чашки) и помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С.

3. Подсчитывают число колоний, выросших на чашке, с учетом снятых. Техника подсчета обычная. Число, выросших колоний умножают на число разведений (в данном случае на 5, так как делали посев в 5 мл сусло) с последующим умножением на 10 (посев разведен 0,1 мл). Например, на чашке выросло 60 колоний: 60Х 5Х 10=3000.

I I I этап - через сутки посев на чашке с картофельным агаром изучают под микроскопом с опущенным конденсором и 8- кратным увеличением. Для этого чашку без крышки книзу дном помещают на столик микроскопа и изучают край штриха посева. Ровный край и четкая просматриваемость клеток округлой формы по ходу штриха свидетельствует о выделении дрожжевых клеток. Наличие у края мицелий в форме нитей, отходящих перпендикулярно от штриха, говорит о выделении дрожжеподобных грибов рода Candida.

Для идентификации видов грибов рода Candida определяют тип филаментации, выявляют наличие хламидоспор, изучают биохимическую активность ферментацию углеводов.

Виду того, что в составе дрожжевой флоры человека преобладает C. albicans, для быстрого диагностирования применяют диагностический тест – трубки прорастания. Для этого берется петля суточной культуры гриба и делается взвесь культуры в 0,5 мл дистиллированной воды. Каплю взвеси стерильной пипеткой наносят на поверхность плотной среды Сабуро и покрывают фламбированным покровным стеклом. Чашку на 2- 3 часа помещают в термостат при температуре 37⁰ С после чего просматривают под микроскопом. Если культура представляет собой C. albicans, то из отдельных бластоспор вытягиваются трубочки. Этот посев можно оставить при температуре 37⁰ С для выявления псевдомицелия или при комнатной температуре – для выявления хламидоспор, которые имеют округлую форму, двухконтурную оболочку и зернистое содержимое. Хламидоспоры образуются на концах нитей и превосходят их по диаметру. Если выявлены трубочки прорастания и хламидоспоры, дается ответ о выделении C. albicans и исследование прекращается. Культуры, не давшие хламидоспор идентифицируют по комплексу признаков: внешнему виду колоний, характеру филаментаций, ферментативной активности.

Филаментация –способность образовывать псевдомицелий. Тип филаментации зависит от характера расположения бластоспор на псевдомицелии. У грибов рода Candida различают 5 типов филаментации.

Mycotorula-правильно расположенные шаровидные вертициллы и мутовки.

Nycotoruloides– крыловидныевертициллы, неравномерно расположенные с обеих сторон псевдомицелия.

Candida– овальные и круглые бластоспоры в местах сочленения псевдомицелия, где в последующем возникают гломерулы.

Mycocandida– ярко выраженный псевдомицелий, типа веток ели, бластоспоры круглые, гломерулы отсутствуют .

Blastodendrion – псевдомицелий древовидный, состоит из полиморфных клеток, вертициллы отсутствуют .

Серологический метод.

Для обнаружения в крови больных специфических антител можно ставить РА, РП, РСК, непрямую РИФ, реакции иммунодиффузии и встречного иммуноэлетрофореза. Высокие титры АТ указывают на активный процесс и поражение внутренних органов. В качестве антигенов используют полисахаридный экстракт из грибов Candida , лизаты и культуры грибов.

Кожно – аллергический метод.

Внутрикожные тесты с кандидозным антигеном дают положительные результаты практически у всех здоровых взрослых людей. Поэтому кожный тест используют в качестве индикатора состояния клеточного иммунитета.

Лечение.

Для лечения локальных форм кандидоза используют нистатин, леворин, амфоглюкамин, а генерализованных – амфотерицин В и глуконазол.

Фикомицеты.

Грибы рода Rhizopus – сапрофитные зигомицеты иногда обнаруживаются в тканях у людей с иммунологическим дефицитом. У больных сахарным диабетом, при обширных ожогах, лейкозе, лимфомах, и при других хронических заболеваниях, грибы рода Rhizopus (Mucor и другие зигомицеты) проникают через стенки кровеносных сосудов и размножаются внутри сосудов, вызывая развитие тромбоза. Это происходит чаще всего в легких, параназальных синусах и желудочно – кишечного тракта и приводит к возникновению ишемического некроза в окружающих тканях с образованием интенсивного полиморфноядерного инфильтрата.

Заболевания называются фикомикоз и мукормикоз.

Возбудителей при жизни больного удается выделить сравнительно редко; в гистологических препаратах они имеют вид широких несептированных нитей мицелия неравномерной толщины, которые располагаются в тромбированных сосудах или синусах и окружены зоной скопления лейкоцитов и гигантских клеток.

Если диагноз зигомикоза установлен при жизни больного, то интенсивное лечение основного заболевания в сочетании с системным применением амфотерицина В, а (в некоторых случаях – и хирургическое удаление пораженных тканей) может привести к ремиссии, а иногда и к выздоровлению больного.

Пневмоциста.

Таксономия.

Pneumocystis carinii – дрожжевой грибок класса Blastomycetes.

Морфология.

Элементарной единицей P. сarinii является спорозоит, имеющий форму округлого тельца с ядром, покрытый бесструктурной оболочкой; размеры его могут варьировать 2Х1,5 мкм до 3Х2 мкм.

Проникнув в альвеолоциты, он преобразуется в плеоморфную промежуточную стадию трофозоита, на основе которого после нескольких циклов деления (чаще 8) спорозоитов диаметром около 1 мкм.

Клиника и эпидемиология.

Пневмацостозом заболевают люди с выраженными иммунодефицитами. Проявляется он в виде интерстициальной пневмонии с поражением межальвеолярных перегородок и накоплением в альвеолах пенистой массы клеточного детрита, содержащего P. сarinii.

У детей заболевания протекает подостро или хронически, а у подростков и взрослых с иммунодефицитами начинается с внезапно возникающей лихорадки и затруднённого дыхания, к которым присоединяются тяжёлый кашель с мокротой. Летальность при быстротечном пневмоцистозе может составлять 100%.

Источником инфекции являются человек, овцы, собаки, грызуны, другие животные. Пути передачи: воздушно-капельный и плацентарный.

Лабораторная диагностика.

Микробиологическая диагностика пневмоцистоза основано на выявлении в мокроте и отделяемом слизистой оболочки верхних дыхательных путей спорозоитов. Мазки окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Используется и серодиагностика, ставят РСК, но наиболее чувствительной является РИФ с антигеном, очищенным от тканевых клеток.

Лечение.

Пневмоцисты резистентны к химическим препаратам. При незначительных нарушениях в иммунном статусе больного терапевтический эффект при пневмоцистозе можно ожидать от применения контримоксазола.