При использовании 3-х пробирок

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

|Число положительных пробирок| НВЧ на 1 г| Пределы с 95% вероятности |

|с разведениями | или 1 мл |——————————————————————————————|

|————————————————————————————| | минимальных |максимальных |

| 1:10 | 1:100 | 1:1000 | | | |

|———————|—————————|——————————|———————————|——————————————|———————————————|

| 0 | 0 | 0 | менее 3| | |

| 0 | 0 | 1 | 3| менее 0,5 | 9 |

| 0 | 1 | 0 | 3| менее 0,5 | 13 |

| 1 | 0 | 0 | 4| менее 0,5 | 20 |

| 1 | 0 | 1 | 7| 1 | 21 |

| 1 | 1 | 0 | 7| 1 | 23 |

| 1 | 1 | 1 | 11| 3 | 36 |

| 1 | 2 | 0 | 11| 3 | 36 |

| 2 | 0 | 0 | 9| 1 | 36 |

| 2 | 0 | 1 | 14| 3 | 37 |

| 2 | 1 | 0 | 15| 3 | 44 |

| 2 | 1 | 1 | 20| 7 | 89 |

| 2 | 2 | 0 | 21| 4 | 47 |

| 2 | 2 | 1 | 28| 10 | 150 |

| 3 | 0 | 0 | 23| 4 | 120 |

| 3 | 0 | 1 | 39| 7 | 130 |

| 3 | 0 | 2 | 64| 15 | 380 |

| 3 | 1 | 0 | 43| 7 | 210 |

| 3 | 1 | 1 | 75| 14 | 230 |

| 3 | 1 | 2 | 120| 30 | 380 |

| 3 | 2 | 0 | 93| 16 | 380 |

| 3 | 2 | 1 | 150| 30 | 440 |

| 3 | 2 | 2 | 210| 35 | 470 |

| 3 | 3 | 0 | 240| 36 | 1300 |

| 3 | 3 | 1 | 460| 71 | 2400 |

| 3 | 3 | 2 | 1100| 150 | 4800 |

| 3 | 3 | 3 | более 2400| | |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

Для дефференциации выделенных культур применяют реакции на индол, метил-рот, Фогэс-Проскауэр и цитрат.

Из пробирок с положительной реакцией (образование газа) штрихом производят посев на чашку с агаром Левина таким образом, чтобы получить изолированные колонии, и инкубируют 18 - 24 часа при 37°С.

Переносят 2 - 3 колонии с каждого выросшего посева на среде Левина на чашку или пробирку с 2% МПА и инкубируют 18 - 24 часа при 37°С. В то же время из каждой культуры готовят мазки и производят окраску по Граму.

Постановка тестов ИМАЦ

Тест на индол

Культуру со скошенного агара инокулируют в пробирку с 5 мл индольной среды (п.6.10.) и инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Добавляют 1 мл индольного реактива. При наличии индола в пограничном слое в течение 5 мин появляется красное окрашивание - положительная реакция.

Реакция Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол)

Культуре со скошенного агара петлей вносят в пробирку с 5 мл среды Кларка (п.6.12.). Посев инкубируют при 37°С в течение 48 часов. Затем к 1 мл культуры, перенесенному в другую пробирку, добавляют 0,6 мл этанолнафтольного реактива и 0,2 мл раствора КОН. Встряхивают после добавления каждого реактива, читают реакцию через 15 минут. Учет результатов возможен и через 2 часа. Окраска от розовой до ярко-красной показывает, что реакция на образование ацетилметилкарбинола положительная.

Тест на метил-рот.

Инокулируют пробирку со средой Кларка и инкубируют в течение 48 часов при 36°С +- 1°С (параллельно с постановкой реакции на ацетилметилкарбинол), в оставшиеся после постановки реакции Фогеса-Проскауэра 4 мл культуры добавляют 4 - 5 капель индикатора метил-рот в каждую пробирку. Реакция ферментации углеводов с образованием кислоты положительная, если появилось красное окрашивание.

Тест с утилизацией цитрата.

Культуру с МПА пересевают в пробирку со средой Козера (цитратной) или на чашку со средой Симмонса, инкубируют 96 часов при 37°С и проверяют рост. Отсутствие роста и изменения цвета среды - реакция отрицательная. Наличие роста, изменение окраски среды с оливково-зеленого цвета на васильковый свидетельствует об утилизации цитрата - реакция положительная.

Таблица 4.4.2.5.

Классификация бактерий группы кишечных палочек

По тестам ИМАЦ

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

|Индол| Метил-рот | Фогес/Проскауэр |Цитрат| ТМП |

|—————|———————————|—————————————————|——————|————————————————————————————|

| + | + | - | - |Типичная E.coli |

| - | + | - | - |Атипичная E.coli |

|—————|———————————|—————————————————|——————|————————————————————————————|

| - | - | + | + |Типичный Ent.aerogenes |

| + | - | + | + |Атипичная Ent.aerogenes |

|—————|———————————|—————————————————|——————|————————————————————————————|

| + | + | - | + |Типичный Citrobacter |

| - | + | - | + |Атипичный Citrobacter |

———————————————————————————————————————————————————————————————————————

Используя табл.4.4.2.5., принимают, что E.coli - это грамотрицательные, неспорообразующие палочки, образующие газ из лактозы и дающие положительную или отрицательную реакцию на индол, положительную - с метил-рот и отрицательные реакции Фогеса-Проскауэра и на цитрат - -(+ - -) или (- + - -). Количество E.coli в 1 г рассчитывают по таблице 4.4.2.3., учитывая число положительных пробирок со средой Кесслер с лактозой или ЕС-бульоном, инкубированных при 44°С +- 1°С. В заключении указывают: "В 1 г (мл) продукта "N" E.coli."

Схема 1.

Определение количества бактерий группы кишечных палочек

Методом НВЧ

1. Гомогенат

продукта

______________

\ /

\__________/

\ /————————> 135 мл 0,1%-й

\______/ пептонной воды

1:10 \ /

\__/———————————> 15 г продукта

| /__\ гомогенизировать при

| 15000 - 20000 об/мин

|

| 1 мл 1 мл

2. Разведение | ———————————————————

гомогената | | | | |

продукта || || || || | | |

|| || || || | | |

|v || |v || | v |

|————| |————| |————|

<————|— | | | | —|————>9 мл пептонной

| | | | | | воды

| | | | | |

\____/ \____/ \____/

1:10 1:100 1:1000

3. Предварительный | | |

тест. | ———— |

Инкубация 1 мл ——|——— ———|——— ———————————

при | | | | | | | | |

37°С 24-48 ч. |

|

| ||

| ||

| |

|

| ||

| ||

Изменение | v||v ||v | |v ||v ||v | |v ||v ||v | цвета |——||——||——| |——||——||——| |——||——||——| среды | || || | | || || | | || || | | || || | | || || | | || || | |@@||@@||@@| |@@||@@||@@| |@@||@@||@@| \__/\__/\__/ \__/\__/\__/ \__/\__/\__/ 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл 1 мл   Среда КОДА     4. Подтверждающий | | | | | тест. | | | | | Инкубация ||

| ||

При 37°С 48 ч. ||

V ||v ||v | |v ||v | |——||——||——| |——||——| | || || | | || | | || || | | || | |@@||@@||@@| |@@||@@| \__/\__/\__/ \__/\__/   Бульон с лактозой, бычьей желчью и бриллиантовым зеленым или ЕС-бульон или среда Кесслер с лактозой.     5. Регистрация пробирок с наличием газа и расчет НВЧ по таблице.   4.4.3. Метод определения коли-титра БГКП. Под коли-титром следует понимать наименьшее количество исследуемой пробы, выраженное в мл (воды, жидкие пищевые продукты) или в г (плотные пищевые продукты), в котором обнаруживается присутствие бактерий группы кишечных палочек. При определении титра кишечных палочек выявляют их наличие в различных объемах исследуемого продукта. При наличии стандартных методов подвергают исследованию те количества продукта, которые предусмотрены соответствующими ГОСТ, весь ход исследования, сроки и температура выращивания, а также количественный и качественный учет кишечных палочек должен соответствовать ГОСТ на тот или иной пищевой продукт. 4.4.3.1. Методика посева пищевых продуктов, не имеющих ГОСТ*(5). Первый этап: Первичные посевы на среду накопления. Засевают 4 или более десятикратно убывающих количеств пищевого продукта, например 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл (Г). В качестве среды накопления применяют среду Кесслер с лактозой или среду КОДА. Среды разливают в пробирки не менее чем по 5 мл для посева малых объемов (1 мл, г и менее). Для посева объема от 10 мл и более среду разливают во флаконы по 50 - 100 мл (применение поплавков не обязательно). Для определения титра бактерий группы кишечных палочек засевают в среду Кесслер исходную 10%-ю взвесь в количестве 100 мл (10 г продукта) во флакон со 100 мл среды двойной концентрации, 10 мл (1 г продукта) - во флакон с 50 мл среды, 1,0 (0,1 г продукта), а также 1,0 мл из разведения 1:100 (0,01 г продукта) и т.д. - в пробирки с 5,0 мл среды. Посевы выдерживают в термостате при 37°С 16 - 24 часа. Второй этап. Посев на плотную среду Эндо. Из всех пробирок с посевами на среде Кесслер или КОДА независимо от помутнения среды, производят посевы на сектора чашек со средой Эндо (при отсутствии среды Эндо пользуются средой Левина). Для получения изолированных колоний берут петлей минимальное количество материала при значительном помутнении среды Кесслер и производят посев частым штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат при 37°С на 16 - 24 часа. Чашки с посевами на среде Эндо просматривают. При отсутствии характерных колоний на всех секторах чашки дают ответ - "титр бактерий группы кишечных палочек более 11,1". При наличии на среде Эндо колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек - красных с металлическим блеском или без него, розовых с темным центром, розовых, слизистых, бледно-розовых, производят их изучение*(6). Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек, готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. В случае обнаружения в препарате смешанной культуры, выбирают другую колонию и производят рассев на чашку со средой Эндо для получения чистой культуры. При отсутствии в мазках грамотрицательных палочек дают ответ - "титр бактерий группы кишечных палочек выше 11,1". Заключение о наличии бактерий группы кишечных палочек только по внешнему виду колоний, без их изучения, недопустимо. В случае обнаружения в препаратах грамотрицательных палочек исследование продолжают. Из проверенных колоний грамотрицательных палочек производят высевы на среду Гисса с глюкозой, разлитую в пробирки с поплавками. При наличии однотипных колоний грамотрицательных палочек на всех 4-х секторах чашки со средой Эндо допускается высев колоний на среду Гисса с глюкозой из двух последних секторов (разведений). Инкубация при 37°С 18 - 24 часа. Для ускорения анализа высевы из колоний производят в пробирки с небольшим количеством подогретой до 37°С среды (1,5 - 2,0 мл). Пробирки с посевами ставят в термостат при 37°С и просматривают через 5 - 6 часов роста. Наличие кислото- и газообразования в них указывает на присутствие бактерий группы кишечных палочек в том или ином засеянном объеме; пробирки с посевами, не забродившими через 4 - 6 часов, вновь помещают в термостат при 37°С и выдерживают до 16 - 24 ч. 4.4.3.2. Учет результатов. Для установления коли-титра применяют стандартные таблицы. Пользование таблицами возможно только при определенном количестве засеянных объемов. Чаще всего для пищевых продуктов, на которые не имеется ГОСТ, используются таблицы, рассчитанные на посевы 4 десятикратно убывающих количеств от 10,0 г до 0,01 г. Если предполагается более интенсивное обсеменение продукта бактериями группы кишечных палочек, то производят посевы больших разведений от 0,001 до 0,00001 г и для вычисления титра бактерий группы кишечных палочек пользуются таблицами 4.4.3.4.; 4.4.3.5.; 4.4.3.6. в зависимости от того, в каком разведении еще обнаруживается рост кишечных палочек, заканчивая учет двумя последними разведениями, в которых имеется наличие (в предпоследней) и отсутствие (в последней пробирке) роста бактерий группы кишечных палочек. Например, 0,1+; 0,01+; 0,001+; 0,0001-. В данном случае следует пользоваться таблицей 4.4.3.5. Для данной комбинации результатов коли-титр равняется 0,0004.