Выделение чистых культур бактерий по методу Дригальского.

Берут 3 чашки Петри с питательной средой. В одну из чашек на питательный агар пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев, после чего чашки помещаются в термостат. В последующем, в извлеченных из термостата чашках в зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии различных бактерий, отличающиеся между собой по форме, цвету, величине, консистенции, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. Отдельную (изолированную) "подозрительную", интересующую исследователя колонию снимают и засевают на скошенный агар. Из остатка колонии готовят микропрепарат и изучают при окраске по Граму. У выросших на скошенном агаре бактерий (как правило, одного вида) определяют биохимические, тинкториальные, антигенные свойства и делают заключение о выделенной культуре бактерий.

При выделении чистой культуры бактерий по Гольду, внесенной на один из 4-х секторов пластинчатого агара в чашке Петри, материал равномерно штрихами засевается по всему сектору и петля прожигается. Охлажденной петлей материал снимается с одного из штрихов первого сектора и переносится во второй, где производится равномерный штриховой посев, аналогичный первому. В третий и четвертый сектор посев делается соответственно из второго и третьего секторов аналогично засеву второго сектора.

После инкубации в термостате наиболее густой рост бактерий выявляется в области первых штрихов первого сектора. В каждом последующем секторе выявляется менее густой рост бактерий, чем в предыдущем, или рост отдельных колоний. Отдельную колонию отвивают на скошенный агар и идентифицируют по тинкториальным, биохимическим, серологическим свойствам.

Данный метод применяется в тех случаях, когда одновременно с выделением чистой культуры необходимо определить количество бактерий в исследуемом материале. Определение количества бактерий всех видов в 1 г (1 мл) материала производят по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения. Количество микроорганизмов в 1,0 г = n'а'b', где n - число колоний, выросших на питательной среде; а - коэффициент посевной дозы (при посеве 0,1 мл а=10, при посеве 0,05 мл а=20); b - степень разведения посевного материала.

Метод серийных разведений (пластинчатых разводок) по Кохутакже применяет для определения количества микробов в исследуемом материале, чаще всего в жидких средах.

Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру.

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Агар-агар, пептон в порошке, МПБ, МПА, сывороточные среды, желчный бульон, сахарный бульон, кровяной агар, среды Гиса, Эндо, Левина, Клиглера, среды обогащения (магниевая, селенитовая), среда 199.

2. Демонстрация всех вариантов посевов и пересевов бактерий: со скошенного агара на скошенный, со скошенного агара на бульон, с бульона на бульон с помощью петли и пастеровской пипетки.

3. Демонстрация методов посева для выделения чистых культур по Дригальскому и Гольду.

4. Клеточные культуры, чистые и зараженные вирусами.

5. Схемы строения куриного эмбриона.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Каждый студент производит пересев со скошенного агара на скошенный.

2. Пересев со скошенного агара на бульон петлей и пастеровской пипеткой (два студента в бригаде).

3. Две бригады студентов из 3-4 человек производят посев взвеси испражнений шпателем по Дригальскому на чашки со средами Эндо и Плоскирева. Две бригады студентов проводят посев слизи из зева в чашки Петри со средой ЖСА.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Каковы основные фазы роста бактериальной популяции в жидкой

питательной среде?

2. Каковы механизмы поступления питательных элементов в бактериальную клетку?

3. Каким требованиям должны отвечать питательные среды?

4. Какие среды называются элективными, дифференциально-диагностическими, универсальными? Примеры.

5. Что такое чистая культура бактерий?

6. В чем сущность бактериологического метода выделения чистой культуры?

7. В чем сущность биолого-бактериологического метода выделения

чистой культуры?

8. Что представляет собой колония бактерий на питательной среде?

9. В чем заключаются культуральные различия разных видов бактерий?