Работа №3. Выведение лейкоцитарной формулы (лейкограммы)
При оценке физиологического состояния организма животных важное значение имеет не только подсчет общего количества лейкоцитов, но и определение процентного соотношения отдельных форм белых клеток крови - лейкоцитарной формулы.
Цель работы: Освоение метода подготовки мазков крови и проведение дифференциации лейкоцитов. Ознакомление с разными формами лейкоцитов. Выведение лейкоформулы (лейкограммы).
Материалы и оборудование: Животное, обезжиренные предметные стекла, стекла с шлифованным краем, краска Романовского-Гимзы, ванночка, колба с дистиллированной водой, 5% раствор йода, вата, марля, смесь спирта с медицинским эфиром,спиртэтиловый, скарификатор, иммерсионное масло, окрашенные мазки крови, микроскоп, осветитель для микроскопа, счетчик для клеток, атлас клеток крови, окрашенные мазки крови.
Ход работы. Для приготовления мазка у животных берут кровь. Каплю крови наносят на край сухого обезжиренного предметного стекла, которое удерживают между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45° подводят шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшийся угол между стеклами был равномерно заполнен кровью. Движением правой руки от себя каплю распределяют тонким слоем по предметному стеклу.
Хорошим мазком будет такой, в котором кровь располагается на поверхности стекла без просветов, в виде равномерной полоски, не выходящей за ее края.
Приготовленный мазок высушивают на воздухе и фиксируют; для этого его кладут в ванночку и наливают на него спирт метиловый на 3-5 мин, или смесь эфира с абсолютным этиловым спиртом 1:1 на 15-20 мин, или хлороформа на несколько секунд. Мазок извлекают из ванночки, высушивают и окрашивают одним из описанных ниже способов. Для окрашивания берут две стеклянные палочки, скрепляют их параллельно резиновыми трубками и кладут в виде подставки над ванночкой и кюветой. На подставке размещают фиксированные и высушенные препараты мазком кверху и окрашивают.
Окраска по Романовскому - Гимзе. Готовую краску предварительно разводят дистиллированной водой из расчета 1 мл на 2-3 капли краски. Полученную смесь наливают на мазок, держат 30-40 мин (в зависимости от температуры воздуха и активности краски), после чего ее смывают дистиллированной водой, а препарат высушивают. Хорошо окрашенный мазок будет розовато-фиолетового цвета, недокрашенный - розово-красного, а перекрашенный - темно-фиолетового цвета.
Окраска по Паппенгейму - Крюкову. Осуществляется в два приема без предварительной фиксации мазка, так как в состав краски входит фиксирующий реактив. В первый прием на сухой мазок наливают 2 мл готовой краски Май-Грюнвальда на 5 мин, а затем 2 мл дистиллированной воды и смешивают ее с краской при помощи пипетки. Через 2 мин эту смесь удаляют. Во второй прием, не высушивая, на мазок наливают краску Романовского-Гимзе на 20 мин, после чего смывают, ее дистиллированной водой и высушивают препарат на воздухе (при такой комбинированной окраске более четко просматриваются зернистость и структура ядра клеток).
На окрашенный мазок крови наносят каплю иммерсионного масла, помещают мазок на столик микроскопа и укрепляют в препаратоводителе. Обеспечивают хорошую освещенность поля зрения при широко открытой диафрагме и поднятом кверху до упора конденсоре. Под визуальным контролем в каплю иммерсионного масла погружают объектив X 90, с помощью микровинта добиваются лучшей видимости и резкости.
При подсчете лейкоцитов по методу меандра мазок условно делят на 4 участка. Затем, отступив от края мазка на 3-4 поля зрения, внимательно просматривают его зигзагообразно, то есть 3-5 полей - вдоль края мазка, затем 3-5 полей - под прямым углом к середине, далее 3-5 полей - параллельно краю мазка и снова под прямым углом возвращаются к краю мазка. В таком порядке микроскопируют каждыйиз условно разделенных участков. Данный способ подсчета не учитывает того, что на периферии мазка относительно больше гранулоцитов, а в глубине лимфоцитов. Поэтому, особенно у животных с лимфатическим и переходным профилем крови (корова, свинья, кролик, коза, овца, курица), лучше вести подсчет через всю ширину мазка.
Рассматривая клетки в мазке, необходимо для контроля сравнивать их с рисунками атласа. При изучении и дифференциации клеток белой крови обращают внимание на величину лейкоцитов, окраску протоплазмы, ее зернистую форму и строение ядра клетки. Для подсчета лейкоцитов можно использовать специальный счетчик, который имеет одиннадцать клавишей; на трех из них имеются цифры, а на восьми - буквы М, Ю, П, Э, соответствующие названию отдельных лейкоцитов (моноциты, юные, палочкоядерные, эозинофилы и т. д.). Над клавишами имеются смотровые окна. В последних, при нажатии соответствующей клавиши, появляются цифры, показывающие количество обнаруженных клеток. В крайнем окне справа автоматически откладывается сумма всех клеток. Как только будет подсчитано 100 лейкоцитоз, в счетчике возникает сигнал, извещающий об окончании подсчета.
Для большей достоверности результатов лучше подсчитать 200 клеток. После подсчета сумму каждого вида лейкоцитов делят пополам и получают процентное их содержание в %. Полученную лейкограмму у разных видов животных анализируют и делают выводы.