Treponema pallidum

1. Изучение бледной трепонемы в мазке из отделяемого твердого шанкра, окрашенного по Романовскому-Гимзе(зарисовать Treponema pallidum (Treponema лат. – сгибающая нить; pallidum- бледная)

В поле зрения видна бледно-розовая трепонема, так как она слабо воспринимает краситель, в то же время другие спирохеты имеют более темный цвет с фиолетовым или синим оттенком. Сифилитическая трепонема тоньше других спирохет, имеет 8–12 завитков, одинаковых по высоте и расстоянию между ними.

2. Знакомство со схемой лабораторного диагноза сифилиса по таблице(записать в тетрадь)

Бледная трепонема вызывает сифилис – первично хроническое инфекционное заболевание человека. Основным методом лабораторной диагностики является серологический, однако, при первичном сифилисе при наличии язвы и вторичном используют микроскопический метод диагностики. Классификация сифилиса:

1. Первичный – развивается спустя 10–90 сут (в среднем 21сут) после заражения.

2. Вторичный – развивается спустя 2–6 мес. После заражения или 2- 10 нед. после появления твердого шанкра.

3. Латентный (скрытый) – стадия болезни, при котором серологические реакции положительны, а какие-либо признаки поражения кожи, слизистых и внутренних органов отсутствуют:

- ранний латентный – менее 2 лет с начала заболевания;

- поздний латентный – более 2 лет с начала заболевания;

- неуточненный латентный.

4. Третичный – развивается через 3-7 лет после начала заболевания (от 2 до 60 лет), гуммы появляются через 15 лет.

5. Врожденный сифилис.

Микроскопический метод. Материалом для исследования при микроскопическом исследовании служат отделяемое твердого шанкра, мокнущих папул, эрозии шейки матки. Язву или другие проявления очищают ватой или марлей, смоченной физиологическим раствором хлорида натрия. Очищенную поверхность язвы осторожно раздражают, растирая края и дно прокаленным и остуженным металлическим шпателем или лопаточкой. Можно сжать края шанкра пальцами или пинцетом. Отделяемое появляется не сразу, каплю отделяемого набирают в пастеровскую пипетку и наносят на тонкое (не толще 1–2 мм) предметное стекло, хорошо очищенное и обезжиренное. Каплю сверху прикрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом в темном поле. Более полное представление дает исследование в фазово-контрастном микроскопе.

При исследовании тканевой жидкости шанкра или папул в темном поле видно большое количество мелких светящихся точек, находящихся в броуновском движении: эритроциты, лейкоциты, эпителиальные клетки. Бледная трепонема в темном поле имеет вид нежной спирали, освещенной ровным светом, слабо блестит, тонкая. Движения ее плавные, изредка она сгибается под углом, особенно характерны для нее маятникообразные движения. Завитки равномерны по ширине, высота их несколько меньше по концам, верхушки закруглены.

Исследование в темном поле наиболее перспективно, но в некоторых случаях применяют исследование материала в окрашенных препаратах. Наилучшие результаты получают при окраске по Романовскому-Гимзе, вполне удовлетворительные результаты дает серебрение по Морозову.

Серологический метод. Серологический метод диагностики является ведущим, он наиболее доступен и его можно, использовать, начиная с 3–4-й недели во все периоды болезни, проводится согласно инструкции по постановке серологических реакций на сифилис, утвержденной в 2001 году. В зависимости от выявляемых антител серологические реакции подразделяются на группы:

А. Нетрепонемные реакции

1. Липидные (реагиновые) реакции:

а) микрореакция преципитации (МР) с липидными антигенами с плазмой крови и инактивированной сывороткой крови;

б) реакция Вассермана: качественная и количественная, термостатная и на холоде;

в) осадочные реакции (реакция преципитации Кана, цитохолевая реакция Закса-Витебского);

Б. Трепонемные реакции

1. Групповые трепонемные реакции:

а) РСК с протеиновым антигеном Рейтера;

б) РИФ;

в) реакция иммунного прилипания (РИП).

2. Видоспецифические протеиновые трепонемные реакции:

а) реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ)

б) РИФ, ИФА

в) реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) бледных трепонем.

Для серологической диагностики всех форм сифилиса, контроля эффективности лечения применяют комплекс серологических реакций, включающий микрореакцию, РСК, реакцию Кана, РИТ и РИФ, ИФА, РНГА. Применение комплекса реакций необходимо потому, что чувствительность реакций при разных формах сифилиса неодинакова.

Микрореакция. Микрореакция преципитации (МР) основана на образовании преципитата при смешивании антител с кардиолипиновым антигеном в виде хлопьев белого цвета. В качестве антител используют плазму крови или сыворотку больного сифилисом. В качестве антигена используют кардиолипиновый антиген, который представляет собой раствор трех очищенных липидов: кардиолипина, лецитина и холестерина. Нельзя использовать кардиолипиновый антиген для РСК.

Для получения плазмы кровь берут из пальца так же, как для определения СОЭ. После отстаивания эритроцитов или центрифугирования плазму отсасывают и используют для постановки реакции только в день взятия крови. Если это требование выполнить нельзя, реакцию микропреципитации ставят с инактивированной сывороткой. Для получения сыворотки кровь берут из вены, после свертывания отсасывают сыворотку и инактивируют как для РСК. МР также ставится с плазмой, но только в день взятия крови из пальца.

Реакцию ставят на стекле или в лунках плестиглассовых пластин, добавляя к капле плазмы или сыворотке по каплям кардиолипиновый антиген. Стекло покачивают 4-5 минут, оценивают результат невооруженным глазом. Присутствие антител «реагинов» вызывает появление крупных хлопьев, которое оценивается как положительный результат по четырехбальной системе. При отсутствии антител наблюдают опалесценцию и оценивают реакцию как отрицательную. МР является отборочным тестом. Количественный вариант МР используется при обследовании больных сифилисом в процессе и после окончания лечения. Существует несколько вариантов микрореакции – VDRL (Veneral Disease Research Laboratory ), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test), RST (Reagin Screen Test), RPR( Rapid Plasma Reagin).

МР обычно отрицательна в первые 7–10 дней после появления твердого шанкра.

Метод иммунофлюоресценции используют для выявления противотрепонемных антител. Существует несколько модификаций РИФ:

– РИФ-200 – с предварительным разведением исследуемой сыворотки 1:200 , что снижает количество ложноположительных реакций

– РИФ-ц – модификация для диагностики сифилитических поражений ЦНС с использованием цельной цереброспинальной жидкости

– РИФ-абс – реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией, когда групповые антитела удаляют из исследуемой сыворотки с помощью абсорции разрушенными ультразвуком культуральными непатогенными трепонемами, что повышает специфичность

– IgM-РИФ- абс– основана на выявлении ранних противотрепонемных антител класса М

РПГА выявляет специфические трепонемные антитела. Применяется как подтверждающий тест на сифилис и для исключения ложноположительных результатов, полученных в МР.

ИФА является наиболее чувствительным и специфическим методом диагностики сифилиса. При её использовании выявляются специфические трепонемные антитела классов IgM и IgG. Метод ИФА применяют для диагностики сифилиса, дифференцирования ложноположительных результатов, полученных в РВ, контроля за эффективностью лечения. ИФА используют вместо РИТ и РИФ.

3. Оценить диагностическую значимость ИФА-диагностики сифилисапо таблице 24 (записать в тетрадь, оформить протокол)

Таблица 24

Варианты	Антитела	Интерпретация результатов ИФА
суммарные	IgM	IgG
	+	+	-	?
	+	+	+	Манифестный сифилис (первичный серопозитивный, вторичный свежий, вторичный рецидивный
	+	-	+	?

4. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения сифилиса (записать в тетрадь)

Антиген кардиолипиновый для реакции микропреципитации (Антиген кардиолипиновый для РМП). Диагностический препарат для использования in vitro. Применяется для диагностики сифилиса для исследования активной плазмы или инактивированной сыворотки в реакции микропреципитации. Способен выявлять антитела к возбудителю сифилиса. Прозрачный бесцветный раствор со специфическим запахом спирта. Представляет собой раствор трех высокоочищенных липидов: кардиолипина, лецитина, холестерина в абсолютном этиловом спирте. 1 мл препарата содержит: кардиолипин-стандарт – 0.3 мг, лецитин-стандарт – 2.7 мг, холестерин – 9 мг, этанол безводный. Раствор холин-хлорида: холин-хлорид – 700 мг, натрия хлорид, вода очищенная. Раствор-комплект: по 2 мл антигена кардиолипинового в ампуле, по 5 ампул; по 5 мл холин-хлорида во флаконе, по одному флакону; по 2 комплекта в пачке. Хранить в сухом, защищенном от света месте, при температуре 15 ± 5 °С.

Транспортировка осуществляется всеми видами крытого транспорта в условиях, исключающих возможность замораживания. Допускается транспортировка при температуре до + 37 °С не более 72 часов. Допускается выпадение крислаллов холестерина на холоде, которые легко растворяются при температуре (37 ± 1) °С.