Тема №11. Антибиотики и антибиотикочувствительность

Цель занятия. Ознакомиться с методами определения активности антибиотиков, чувствительности и устойчивости бактерий к ним.

Материалы и оборудование: чашки Петри, пробирки, стандартные диски с антибиотиками, культуры микроорганизмов, колбы, линейки, термостат.

Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности бактерий, грибов, растений и животных, обладающие активностью по отношению к микроорганизмам, способные задерживать рост (бактериостатическое действие) или полностью подавлять их жизнедеятельность (бактерицидное действие).

Биологическую активность антибиотиков выражают в единицах действия (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл). За одну единицу принимают минимальное количество антибиотика, которое подавляет рост стандартного тест – микроба в строго определенном объеме питательной среды. Большинство антибиотиков в 1 мг вещества содержит 1000 ЕД, однако у разных антибиотиков она неодинакова: 1 ЕД пенициллина = 0,6 мкг, стрептомицина – 1 мкг чистого вещества. Весовое количество антибиотика равное его 1 ЕД называют международной единицей действия (МЕ).

Для определения активности антибиотика используют биологический метод (есть и химический), в основе которого лежит выявление интенсивности воздействия препарата на живую микробную клетку.

В ветеринарной практике антибиотики используют для лечения инфекционных болезней с учетом спектра действия. С этой целью устанавливают возбудителя болезни (проведение бак. исследования), с последующей проверкой чувствительности (или резистентности) выделенного вида микроба к антибиотикам. При выявлении возбудителя инфекционного заболевания и его чувствительности к антибиотикам предпочтительно применение препаратов узкого спектра действия. Антибиотики же широкого спектра назначают при тяжелом течении заболевания и при смешанной инфекции.

Чувствительность микроба к антибиотикам выражается задержкой роста или гибелью от минимальной концентрации препарата (мкг, ЕД/мл) в течение 16 – 18 ч.

Чувствительность микроба к антибиотикам проверяют методами:

· диффузионные методы (с использованием дисков с антибиотиками, с помощью Е-тестов

· методы разведения (разведение в жидкой питательной среде (бульоне), разведение в агаре

Метод серийных разведений — заключается в том, что в жидкой или твердой питательной среде готовят различные разведения антибиотиков, сеют на эту среду культуру микроорганизма, хранят в термостате на протяжении суток. Наименьшая концентрация антибиотика в среде, в которой наблюдается полная задержка роста культуры микроорганизма, называется минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Последняя определяет степень чувствительности микробов к данному антибиотику. Она измеряется в мкг/мл или мг/мл. В зависимости от величины МПК все штаммы микроорганизма подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные к конкретному антибактериальному препарату. Метод серийных разведений дает более точные количественные результаты, позволяющие сопоставить чувствительность изучаемой культуры,

Метод серийных разведений включает следующие этапы: выбор питательных сред, приготовление растворов антибиотиков, подготовка микробных культур для исследования и учет результатов.

Питательная среда должна обеспечивать оптимальный рост культуры микроба.

Для аэробов используют: МПБ (рН 7,2-7,4) и бульон Хоттингера (рН 7,4-7,6); МПА 2%-ый или 2% агар на переваре Хоттингера, 2% агар с 5% кровью или сыворотки.

Для анаэробов используют среду Кита-Тароцци без кусочков печени с 0,5% глюкозой (рН 7,4-7,6). В жидкой среде при определении чувствительности одного штамма микроба к одному антибиотику необходимо иметь 6 пробирок с 2 мл среды в каждой (для серийного разведения антибиотика), 2 пробирки по 9-10 мл среды для разведения культуры микроба и колбу с питательной средой для приготовления рабочего раствора антибиотика. Сначала готовят его основной раствор (используя также стандарты антибиотиков определенной активности) из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл растворителя (дистиллированная вода, буферный раствор). Рабочие растворы готовят на питательной среде из основного раствора методом последовательных двукратных разведений, чтобы в 1мл среды концентрация антибиотика была соответственно, начиная с 1ой пробирки – 0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015; 0, 007мкг.

При использовании плотной среды рабочие разведения антибиотиков готовят в 6 пробирках так, чтобы количество препарата в 1ой пробирке – 400, 2ая – 200; 3я – 100; 4ая – 50; 5ая – 25; 6ая – 12,5 мкг/мл. Из каждой пробирки по 1 мл разведенного антибиотика стерильной пипеткой переносят в чашку Петри и добавляют в нее 19 мл расплавленного (и охлажденного до 55°С) МПА, вращательными движениями смешивают и оставляют на столе да затвердения среды. Концентрация препарата в чашках Петри становится в 20 раз ниже, чем в пробирках (соответственно 20; 10; 5; 2,5; 1,25 и 0,6 мкг/мл). В ряды пробирок или чашек Петри с питательной средой, содержащие разведенный антибиотик, засевают чистую 16 – 18 часовую бульонную культуру микроба. Если культура выращена на плотной среде, готовят смыв, доводят до концентрации 500 млн. микробных тел в 1 мл и засевают. Отмечают пробирку (или чашку), в которой отсутствует рост. Количество антибиотика в ней и в последующей пробирке (чашке), где наблюдается рост бактерий, складывают, выводят среднее арифметическое, которое показывает чувствительность микроорганизма к данному антибиотику. Наличие роста свидетельствует о резистентности к препарату.

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест (рис. 4). Этим методом на чашке Петри с агаром определяют МПК в точке пересечения эллипсовидной зоны угнетения роста микроорганизма вокруг пластиковой полоски Е-теста со специальной шкалой, нанесенной на эту полоску (рис.3). В соответствии с полученным значением МПК все штаммы микроорганизмов подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные к определенному антибиотику. (Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.) Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Рис. 4. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

В лабораторной практике часто используют метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики (рис. 5). Для этого питательную среду разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. На поверхность уплотнившейся среды наливают 1 мл одномиллиардной взвеси (0,9%-ном растворе NaCl) агаровой культуры микроба. Легким покачиванием чашки культуру равномерно распределяют по питательной среде, излишек жидкости отсасывают стерильной пастеровской пипеткой. Чашки подсушивают в термостате 15 минут (37°С) или при комнатной температуре 30 – 40 мин. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают (прижимают) стандартные бумажные диски с разными антибиотиками на расстоянии 2 см от края и друг от друга, 1 диск – в центре чашки. Сначала чашки выдерживают при комнатной температуре (2ч), затем, перевернув их вверх дном, помещают в термостат на 16 – 18 ч (37°С). Оценку результатов проводят с учетом наличия или отсутствия зоны задержки роста, размера зоны вокруг диска с антибиотика (рис.4). Отсутствие зоны задержки роста бактерий свидетельствует о нечувствительности их к данному препарату. При появлении задержки роста ее измеряют по диаметру с помощью линейки. Зона задержки до 15мм является показателем малой чувствительности, зона в 15 – 25 мм указывает на достаточную чувствительность испытуемой бактериальной культуры. Чем больше задержка роста бактерий, тем выше их чувствительности к данному препарату.

	Рис. 5. Метод диффузии в агар (метод дисков).