Техника приготовления препарата.
Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок наносят 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1 - 2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, промокая его фильтровальной бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла и микроскопируют с иммерсионной системой.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории.
2. Современные методы работы с иммерсионным объективом.
3. Устройство фазово-контрастного, электронного и люминесцентного микроскопов.
4. Микроскопия в темном поле
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Каждый студент микроскопирует с сухим и иммерсионным объективом готовые окрашенные мазки дрожжей, антракоида, стафилококка, стрептококка.
2. Каждый студент готовит 3 мазка препарата из бактериальных культур: сарцина, стафилококка, антракоида, кишечной палочки, вибриона; окрашивает фуксином Пфейффера, метиленовой синькой; микроскопирует с иммерсионным объективом; зарисовывает изображением.
3. В ходе работы необходимо освоить и записать в тетрадь: а) методы обеззараживания отработанного материала и контаминированных микробами объектов внешней среды; б) методы антисептической обработки рук, контаминированных исследуемым материалом, культурами патогенных микробов.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие задачи выполняет медицинская микробиология?
2. Какова структура и оснащение микробиологической лаборатории?
3. Почему необходимо выполнять правила работы в микробиологической лаборатории? В чем они заключаются?
4. Как определить увеличение микроскопа?
5. Что такое разрешающая способность микроскопа и от каких факторов она зависит?
6. Каковы преимущества иммерсионного объектива?
7. Изложите правила работы с иммерсионным объективом.
8. Из каких двух основных систем состоит электронный микроскоп?
9. Каковы основные отличия электронного микроскопа от светового?
10. Как готовят препараты для электронной микроскопии?
11. Основные принципы работы фазово-контрастного микроскопа.
12. Основные принципы работы люминесцентного микроскопа.
13. Принцип микроскопии в тёмном поле.
14. Что лежит в основе выбора метода микроскопического исследования микропрепаратов?
15. Назовите основные формы шаровидных, палочковидных и извитых бактерий.
16. Из каких этапов состоит процесс приготовления мазка?
17. Для чего осуществляют фиксацию бактериального микропрепарата и как она проводится?
18. Что такое тинкториальные свойства бактерий?
19. Назовите основные краски, применяемые для окраски микропрепаратов
20. Для чего изучают тинкториальные свойства бактерий?
21. Что такое простая окраска?
ЗАНЯТИЕ №2
Тема:
• Структура бактериальной клетки, сложные методы окраски (метод Грама), подвижность бактерий.
План занятия:
1. Строение бактериальной клетки.
2. Сложные методы окраски. Окраска по Граму.
3. Исследование микроорганизмов в живом состоянии, подвижность бактерий.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
По классификации Берджи все микроорганизмы подразделены на три царства: I- Эукариот, II - Прокариот, III- царство -Vira. Бактерии относятся к прокариотам. Клетки прокариот имеют более простое строение, чем клетки эукариот. Они имеют: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, рибосомы, мезосомы и ядерную субстанцию (нуклеоид), состоящую из ДНК, связанную с небольшим количеством РНК. Ядерная субстанция расположена свободно в цитоплазме, так как не имеет ядерной оболочки. Эти компоненты являются обязательными. Кроме того, бактериальная клетка может иметь необязательные (дополнительные) компоненты, такие как капсула, споры, жгутики, включения (например, зерна волютина). Они выявляются с помощью сложных методов окраски или специальных методов исследования (например, микроскопия препаратов, приготовленных из живых микроорганизмов), что может иметь большое значение для идентификации бактерий.
Цель занятия:
1. Ознакомиться со структурными (дифференциальными) особенностями прокариот и овладеть некоторыми методами их изучения (окраска по Граму и изучение подвижности).
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1 Постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки, их функции.
2. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий.
3. Методы изучения структурных особенностей микроорганизмов в нативном и окрашенном состоянии:
а) технику приготовления и особенности микроскопии нативных препаратов;
б) сложный метод окраски по Граму.
Уметь:
1. Окрасить препарат методом Грама.
2. Приготовить и микроскопировать препараты из живых бактерий
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
1. При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие - дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др., которые играют роль дифференциаторов. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, запасные вещества, включения и т. д.)
Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианвиолета и йода, либо терять его после обработки спиртом. В характеристике микроба каждого вида обязательно указывают на отношение к окраске по Граму. Все бактерии по отношению к этому методу окраски делятся на две группы: грамположительные: (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генциан - виолета и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды - муреин (пептидогликан) в соединении с тейхоевой кислотой и рибонуклеатом магния. У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располоагается в глубине клетки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется также меньшим диаметром пор у грамположительных бактерий, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.
Техника окраски по Граму (модификация Синева)
1. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, окрашенной карболовым генцианвиолетом, и смачивают несколькими каплями воды.
2. Через полторы-две минуты бумажную полоску снимают и на препарат наносят раствор Люголя на 1 минуту.
3. Сливают раствор Люголя и, не промывая водой, действуют спиртом несколько секунд, до прекращения отхождения красителя от мазка.
4. Тщательно промывают препарат водой.
5. Докрашивают разведенным фуксином 1-2 минуты.
6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают препарат с иммерсионной системой.
Грамположительные микробы - фиолетового цвета, грамотрицательные - красного.
2. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий иногда используют неокрашенные препараты (нативные), приготовленные из естественный образцов либо из колоний выросших микроорганизмов. Нативные препараты чаще всего готовят для исследования живых неокрашенных бактерий в целях установления их подвижности. Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя светлопольный микроскоп с приспущенным конденсором, но лучше всего его исследовать в темном поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа. Для прижизненного изучения бактерий часто используют методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами.
Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды. В нее стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю. Препарат микроскопируют с использованием объективов х40 или х90.
Препарат «висячая капля» используют при продолжительном наблюдении за ростом и развитием микроорганизмов. Небольшая капля бульонной культуры микроорганизмов помещается с помощью бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с лункой. Капля должна свободно свисать в лунку, не затрагивая ее краев и дна. Для создания влажной камеры и предохранения от высыхания края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют также, как и препарат «раздавленная капля».
Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском.
Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитри-хиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания. Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, КА1(SO4)2, НgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности.
Подвижность бактерий может быть выявлена путем использования техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 - 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Методика окраски по Граму
2. Приготовление препарата «висячая капля» из живых подвижных бактерий (вибрион), микроскопирование в фазово-контрастном микроскопе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Приготовить препараты из грамположительных и грамотрицательных культур (стафилококка, антракоида, кишечной палочки, вибриона), окрасить по Грамму, микроскопировать, зарисовать.
2. Приготовить препарат «раздавленная капля» из зубного налета и чистой культуры водного вибриона, микроскопировать в темном поле, зарисовать результат.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. В чем заключаются различия в анатомии эукариот и прокариот?
2. Какие свойства бактерий можно изучить в результате окраски простыми и сложными методами?
3. Какие методы окраски называют дифференциальными? Назовите их.
4. Какие свойства бактерий влияют на их способность воспринимать
разные красители?
5.Какой метод окраски позволяет разделить все бактерии на две альтернативные группы?
6.Каково строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий?
7. Объясните последовательность и механизм окраски по Граму. В какой цвет при этом могут окрашиваться бактерии и почему?
8. Назовите морфологические разновидности грамположительных и грамотрицательных бактерий.
9. Какое значение имеют жгутики в биологии бактерий?
10. Как определяют подвижность бактерий микроскопическим методом?
11. Как определяют подвижность бактерий методом посевов?
12. Какое практическое значение имеет изучение подвижности бактерий?
13. Как готовятся «висячая» и «раздавленная» капли и каковы особенности их микроскопии?
14. Какие существуют варианты расположения жгутиков у бактерий?
15. Как обнаружить жгутики у бактерий?
ЗАНЯТИЕ №3
Тема: