Ход микробиологического исследования

Первый день.

Выделение гемофильных микробов из материалов от больных и их идентификацию следует проводить по этапам.

Бактериоскопический метод: мазки из исследуемого материала или культуру, окрашенные по Граму, просматривают под микроскопом с иммерсией. Обнаружение в мазках мелких палочек равномерно окрашенных в бледно - красный цвет позволяет заподозрить наличие в исследуемом материале гемофилов.

Культуральный метод: исследуемый материал засевают бактериологической петлей на чашку с кровяным или шоколадным агаром. Кровь, посеянную на жидкие питательные среды, термостатируют при 37⁰. С в атмосфере с 5%-10% СО2 полученной в эксикаторе с зажженной свечой.

Второй день.

На агаре с нативной кровью (5%-10%) гемофилы растут в виде чрезвычайно мелких полупрозрачных колоний (диаметр 0,5 мм и менее), не имеющих характерных особенностей, их трудно дифференцировать от колоний других видов бактерий.

На шоколадном агаре гемофилы растут в виде полупрозрачных, сероватых, нежных, сочных колоний диаметром от 1 до 2 мм; в зависимости от состояний популяции могут формировать три вида колоний: крупные, круглые слизистые колонии (М-форма); круглые, полупрозрачные голубоватые колонии размером до 1 мм (S-формы); очень мелкие, менее 1 мм в диаметре, непрозрачные колонии (R-форма). В мазках из М- и S-колоний, окрашенных по Граму, видны мелкие грамотрицательные палочки; для R-форм характерен полиморфизм, встречаются и нитевидные формы. При окраске тушью по Гинсу у М- и S-форм вокруг клеток видна капсула, хорошо выраженная у М-форм и небольшая у S-форм. При росте на шоколадном агаре культура Н. influenzae обладает "мышиным" запахом, что является одним из характерных признаков этой группы микробов.

Для накопления биомассы, необходимой при идентификации культур по биохимическим тестам, после микроскопирования подозрительные колонии отсевают штрихом в пробирки на шоколадный агар.

Одновременно проводят повторный высев подозрительных колоний на питательный агар без крови и дрожжевых добавок. Посевы помещают в термостат при 37 град. С на 18-24 часа.

Отсутствие роста культуры на питательном агаре без крови и обнаружение в мазках из колоний, выросших на шоколадном агаре, мелких грамотрицательных палочек с капсулой или без нее, является первым этапом подтверждения выделения одного из видов гемофильных микробов.

При росте на шоколадном агаре большого числа однотипных колоний культуру можно изучить на наличие ферментов каталазы, оксидазы, уреазы, бета - галактозидазы, образование индола, редукции нитратов (таблица 9), определяют чувствительность к антибиотикам.

Таблица 9

Биохимические свойства видов рода Haemophilus.

Виды	Факторы роста	каталаза	оксидаза	б-галактозидаза	уреаза	Редукция нитратов	индол	гемолиз	глюкоза	лактоза
Н. influenzae	XV	++	-	-	+	+	+-1	-	+	-
H. aegyptius	XV	+	-	+	+	+	-	-	+	-
Н. parainflu¦ enzae	V	+	-	+	-	+	-	-	+	-
Н. haemolyti us	XV	+	-	+	-	+	-	+	+	+
H. aphrophi lus	X	+2	-	+	-	+	-	-	+	+
H. ducreyi	X	-	-	-	-	+	-	-	-	-

Примечание:¹ - положительная реакция у капсульных штаммов;²- положительная реакция слабая.

Эти тесты позволяют подтвердить выделение гемофилов и дать ориентировочный ответ о выделении Н. influenzae уже через 24 часа после получения материала для бактериологического исследования.

Третий день. Из культур, выросших на шоколадном агаре, готовят мазки и окрашивают по Граму и Гинсу. Культуру идентифицируют до вида по тестам (см. табл. 9 и 10).

В ряде случаев при исследовании спинномозговой жидкости, крови, особенно при отсутствии четких результатов при бактериоскопии, культуру гемофилов необходимо отдифференцировать от менингококков, нейссерий, пневмококков и др. (см. табл. 10).

Таблица 10

Основные дифференцирующие признаки Н. influenzae от некоторых других микробов, возбудителей бактериальных инфекций человека одной локализации.

Вид, род	Рост на агаре	Морфоло-гия клеток (окраска по Граму)	каталаза	оксидаза	Б-галактозидаза	уреаза
без кро-ви	с гре-той кровью
Н. influenzae	-	+1	Грамотрицательные мелкие палочки
N. meningitidis	-	+	Грамотрицательные бобовидные диплококки
Neisseria sp.	+	+	Грамотрицательные ¦крупные кокки
Branhamella	+	+	Грамотрицательные крупные кокки
Moraxella	-	+	Грамотрицательные кокко-бациллы
Acinetobacter	+	+	Грамотрицательные кокко-бациллы
S. pneumoniae	-	+2	Грамположительные¦ диплококки

Приложение:¹ - характерный "мышиный" запах; ² - вокруг колоний цвет среды зеленеет.

Регистрируют результаты реакции на ферменты каталазу, оксидазу, бета - галактозидазу и уреазу. Это позволяет уже на 3-й день исследования, т.е. через 48 часов, определить вид микроба.

Четвертый день. Регистрируют результаты по дополнительным биохимическим тестам. На основании комплекса изученных биологических свойств проводят окончательную идентификацию выделенных культур.

Выдается окончательный ответ о выделении того или иного вида из рода Haemophilus.