Определение концентрации биомассы

Определение числа микробных клеток в суспензии - один из наи­более важных параметров при характеристике, образованной в результате культивирования биомассы. Существует несколько методов опреде­ления концентрации биомассы.

Число одноклеточных организмов можно определить микроскопи­ческим методом, подсчитав отдельные клетки в точно измеренном малом объеме. Такой подсчет обычно делается на специальных предмет­ных стеклах - счетных камерах. На них начерчены квадраты извест­ной площади, и их конструкция позволяет внести между предметным и покровным стеклами слой жидкости известной толщины. Следовательно, можно точно вычислять объем жидкости, покрывающей каждый квадрат. Такой прямой подсчет называют определением общего числа клеток. Он учитывает как живые, так и мертвые клетки, поскольку их нель­зя различить в случае бактерий. Визуальные подсчеты имеют то преимущество, что наблюдатель может различить вида микроорганизмов,

которые необходимо подсчитать, а другие типы частиц или организмов в среде. Основное ограничение прямого микроскопического подсчета численности микробной популяции - необходимость, иметь относительно высокие концентрации в суспензии. Большое увеличение, позволяющее регистрировать бактерии, в то же время ограничивает объем жидкости, который можно подвергнуть тщательному исследованию под микроскопом. Тем не менее в известном объеме должно содержаться достаточное число клеток, чтобы сделать подсчет статически значимым. В результате данным методом можно анализировать с любой степенью точностью только те суспензии, которые содержат не менее 10 млн клеток в 1 мл.

Для прямого подсчета клеток в суспензии используют также электронный прибор, названный по имени его изобретателя счетчиком Коултера. Порцию суспензии пропускают через очень тонкое отверстие в небольшой стеклянной трубке. Это отверстие служит, кроме того, и для замыкания электрического тока, проходящего через среду между электродами, расположенными внутри трубки и на ее внешней поверхности. Определение основано на различии в проводимости между бактерией и окружающей средой. Каждый раз, когда бактериальная клетка проходит через отверстие, проводимость падает, что обнаруживается и регистрируется электронным счетчиком. Прибор может различать величину и длительность изменений проводимости и таким образом регистрировать и записывать не только число клеток в популяции, но и распределение по размеру. Отверстие, обычно используемое для подсчета бактерий, имеет диаметр 30 мкм, поэтому среда, в которой находятся клетки, должна быть тщательно освобождена от посторонних частиц (например, пыли), так как мельчайшие их них будут подсчитаны как бактерии, а более крупные закупорят отверстие. Электронные приборы для счета удобны при большом числе измерений и уменьшают ошибку выборки, так как дают возможность подсчитать большое число проб.

Для ориентировочного подсчета общего количества клеток в суспензии часто пользуются бактериальным стандартом мутности, который содержит в единице объема (I мл) заданное количество микробных клеток (м.к.). Стандарт мутности для определения концентрации микробной взвеси, выпускаемым Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов имени П.А. Тарасевича, представляет взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла «Пирекс» диаметром от 0.5 до 3.5 мкм. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной концентрации и мутности.

Стандарт состоит из двух запаянных пробирок - эталонов, экви­валентных по степени мутности 5 и 10 международным единицам мутнос­ти. К комплекту бактериальных эталонов прилагается шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствует пробиркам - эталонам, так как при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой. Определение концентрации микробной взвеси с помомощью стандарта мутности проводят следущим образом:

Небольшое количество микробной взвеси, в которой необходимо определить концентрацию биомассы(0.1-0.2 мл), переносят в стандартную пробирку или близкую к ней по диаметру и толщине стенок. Далее к содержимому этой пробирки небольшими, но точно учитываемыми порциями приливают изотонический раствор хлорида натрия, сравнивая при этом мутность опытной побирки с эталоном 10 единиц. Сравнение степени мутности в опытной и эталонной пробирках производят невооруженным глазом при хорошем дневном освещении в лучах падающего света, подложив под обе пробирки шрифтовую таблицу.

Зная количество физиологического раствора, прибавленное к определенному объему микробной взвеси, можно определить число микробных клеток, содержащихся в 1 мл. исходной бактериальной суспензии.

Например, при приготовлении микробной взвеси бацилл, по мутности соответствующей 10 единицам эталона (концентрации 1 млрд. м.к./мл), было взято 0.1 мл исследуемой суспензии и 1.5 мл физиологического раствора. Полученная взвесь в объеме 1.6 мл имеет концентрацию эталона, то есть 1 млрд. М.к. в 1 мл. Таким образом, в 1 мл исходной взвеси содержится 1.6 млрд. клеток, а концентрация суспензии – 16 млрд. м.к./мл.

Число одноклеточных микроорганизмов можно подсчитать также после высева на плотную питательную среду в чашки Петри (макрокультуральный метод), поскольку жизнеспособные клетки, пространственно отдаленные друг от друга во всем объеме агаризованной среды или на ее поверхности, в процессе роста образуют отдельные макроскопические колонии. Следовательно, приготовив соответствующие разведения бактериальной популяции и использовав их для засева подходящей среды, можно определить число жизнеспособных клеток в исходной суспензии путем подсчета числа вырастающих после инкубации колоний и умножения этой цифры на коэффициент разведения. В отличие от прямого микроскопического или электронного подсчета, такой метод обычно на­зывают определением концентрации жизнеспособных клеток, поскольку он позволяет учесть только те микроорганизмы, которые могут расти на использованной для посева среде.

Методика определения концентрации живых клеток заключается в следующем:

Исследуемую микробную взвесь последовательно разводят в пробирках с 10-ти кратным объемом физиологического раствора. Для этого в стерильные пробирки наливают по 0.9 мл. стерильного физиологического раствора. Количество пробирок зависит от общей концентрации микробной взвеси, так как ее разводят так, чтобы в последней пробирке содержалось примерно тысяча микробных клеток в 1 мл разводящей жидкости. В первую пробирку ряда вносят 0.1 мл. исследуемой взвеси, закрывают ватно-марлевой пробкой и тщательно, но осторожно перемешивают, вращая несколько раз между ладонями. Затем из этой пробирки стерильной градуированной пипеткой берут 0.1 мл взвеси и переносят во 2-ю пробирку ряда. Далее, после перемешивания 0.1 мл содержимого 2-й пробирки переносят стерильной градуированной пипеткой в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество – в 4-ю из 4-й – в 5-ю и так далее. Из последней пробирки ряда по 0.1 мл суспензии высевают на пластинки питательного агара в 3 чашки Петри и тщательно раскатывают посевную дозу до поверхности среды осторожным покачиванием чашки. После впитывания микробной взвеси в агар чашки с посевами помещают в термостат. Через 24 часа производят подсчет количества колоний в чашках с питательной средой. Из 3-х значений высчитывают среднее количество выросших колоний и определяют кон­центрацию живых клеток исследуемой суспензии ( С_ж ):

п - среднее количество выросших колоний

а- количество пробирок, взятых для разведения культуры.

Определение концентрации жизнеспособных клеток является наиболее чувствительным мето­дом количественного учета микроорганизмов, так как дает возможность зарегистрировать даже единичную живую клетку в суспензии.

Для установления процента жизнеспособности клеток в микробной популяции необходимо использовать метода отдельного определения об­щего числа клеток и числа жизнеспособных клеток в единице объема.

Процент жизнеспособности (К) вычисляется по следующей формуле:

, где

С_ж - концентрация живых клеток, м.к./мл,

Собщ - общая концентрация микроорганизмов в суспензии, м.к./мл.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ

1) Произвести посев бактериологической петлей микробной культуры, выданной преподавателем, в одну пробирку с жидкой пита­тельной средой, в одну пробирку со скошенным агаром ("косяк") и на пластинку плотной питательной среды в чашке Петри.

2) Определить общую концентрацию живых и мертвых клеток во взвеси, полученной у преподавателя, с помощью бактериологическо­го стандарта мутности. Результаты определения занести в табл. 1.

3) Определить концентрацию жизнеспособных клеток в той же микробной суспензии макрокультуральным методом. Результаты опыта занести в табл. 2.

4) Вычислить процент жизнеспособности микробной популяции по результатам определения общей и жизнеспособной концентрации клеток в суспензии.

Таблица 1. Результаты измерений общей концентрации биомассы

Вид микроба	Объем взятой взвеси, мл	Объем добавленного физ. раствора, мл	Концентрация полученной взвеси, м.к./мл	Концентрация исходной взвеси, м.к./мл

Таблица 2.Результаты определения концентрации живых клеток в биомассе.

Кол-во пробирок	Объем физ. р-ра в пробирке, мл	Объем титруемой взвеси, мл	Объем посевной дозы, мл	Количество колоний	Концентрация живых клеток,
			среднее

Отчет студента по выполненной работе должен содержать:

1) Цель работы.

2) Этапы выполнения работы.

3) Таблицы с результатами определения общей и жизнеспособной концентрации биомассы.

4) Расчет процента жизнеспособности микробной популяции.

5) Выводы по проделанной работе.