Ход микробиологического исследования
Первый день. При целенаправленном исследовании на псевдомонады в случае госпитальной вспышки инфекции, вызванной синегнойной палочкой, посев производят на селективную среду ЦПХ-агар бактериологической петлей или ватным тампоном. В случае исследования воздуха при определении обсемененности больничных помещений синегнойной палочкой седиментационным методом экспозиция открытых чашек с агаром составляет 2-3 часа.
Если исследование не является целенаправленным в отношении выявления псевдомонад, то посев производят на любую из общепринятых питательных сред: 1,5% питательный агар, 5% кровяной агар, агар Эндо. Все посевы инкубируют в термостате при 37 град. С в течение 18-24 часов.
Второй день. Засеянные накануне исследуемым материалом агаровые чашки просматривают и отмечают колонии, подлежащие дальнейшему изучению. Различают 5 морфологических типов колоний: 1) плоские колонии неправильной формы; 2) колонии, напоминающие кишечную палочку; 3) складчатые ("цветок маргаритки"); 4) слизистые, редко дающие пигментацию при первичном выделении, образующие слизистый налет, со временем приобретающий зеленую окраску; 5) карликовые, которые появляются только через 18 часов. На кровяном агаре вокруг колоний видны зоны гемолиза. Очень часто можно наблюдать феномен "радужного лизиса" культур, который характеризуется наличием нежного блестящего металлического налета и зон лизиса. На среде Эндо культуры синегнойной палочки образуют бледно - розовые колонии небольших размеров. Культуры синегнойной палочки образуют синий или зеленовато - синий или фиолетовый пигменты, проникающие в субстраты. Один из них - пиоцианин, дающий синюю или сине - зеленую окраску. Другой - флюоресцеин - дает зеленовато - желтое окрашивание, флюоресцирующее в проходящем свете в УФ-лучах.
Пиоцианин образуют только штаммы синегнойной палочки, другие представители рода Pseudomonas могут образовывать флюоресцеин.
При просмотре мазков, окрашенных по Граму, выявляются грамотрицательные палочки размером 1,5-3,0 х 0,4-0,6 мкм, располагающиеся одиночно, парами или короткими цепочками, не образующими спор, но продуцирующие слизь, окружающую микробную клетку тонким слоем.
Таким образом, уже на второй день можно идентифицировать примерно 75% выделенных культур синегнойной палочки по наличию роста на селективной среде, морфологии колоний, образованию сине - зеленого пигмента (пиоцианина) и специфическому запаху жасмина или земляничного мыла.
Беспигментные колонии, выросшие на селективной среде, и колонии, подозрительные на псевдомонады, с других сред исследуют на способность образовывать цитохромоксидазу. Для этого можно использовать индикаторные бумажки СИБ.
Исследуемую культуру наносят на смоченную физиологическим раствором индикаторную бумажку. При положительной реакции на месте нанесения культуры появляется синее окрашивание бумаги в течение 30 секунд.
Беспигментные колонии, давшие положительный цитохромоксидазный тест, отбирают и суспендируют в 0,5 мл физиологического раствора, а затем отсеивают на следующие питательные среды.
Среда Кинг А используется для усиления способности синегнойной палочки продуцировать сине - зеленый пигмент пиоцианин. Некоторые штаммы синегнойной палочки образуют на этой среде другой пигмент - пиорубин, дающий красное окрашивание.
Среда Хью-Лейфсена с глюкозой. Применяют для определения способности псевдомонад окислять глюкозу до глюконовой кислоты только в аэробных условиях. Посев производят уколом в 2 столбика агара, один из которых заливают 1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37 град. С. При положительной реакции происходит порозовение среды в столбике без вазелина, а при отсутствии роста в анаэробных условиях цвет среды не меняется.
Ацетамидный агар является дифференциальной средой для синегнойной палочки, поскольку она обладает способностью использовать ацетамид в качестве единственного источника азота и углерода.
2 косяка с питательным агаром для определения способности культур к росту при 420 С и 50 С.
Все засеянные среды инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 370 С, кроме последних, которые ставят соответственно в термостат при 420 С и в холодильный шкаф.
Третий день. Просматривают результаты посевов второго дня. На среде Кинг А в случае высева синегнойной палочки вокруг выросших колоний можно видеть сине - зеленое окрашивание, однако, оно может и отсутствовать, если штамм не образует пиоцианина. Если данный микроорганизм принадлежит к роду Pseudomonas, то окисление глюкозы происходит только в аэробных условиях. Рост культур на ацетамидном агаре, способность культур расти при температуре 420 С и отсутствие роста при 50. С позволяет отнести выделенную культуру к виду P. aeruginosa. Если культура выросла на ацетамидном агаре, но не выросла при 420. С, то она принадлежит к виду P. putida. P. fluorescens характеризуется неспособностью утилизировать ацетамид и расти при 420 С, но хорошо растет при 50 С. Основные дифференциальные признаки флуоресцирующих псевдомонад приведены в табл. 15.
Таблица 15
Основные дифференцирующие признаки флуоресцирующих псевдомонад (Pseudomonas).
| Тест или субстрат | Вид | ||
| Ps. aeruginosa | Ps. fluorescens | Ps. putida | |
| Цитохромоксидаза | |||
| Пигмент пиоцианин | |||
| Флуоресценция | |||
| Глюкоза | |||
| Рост на ацетамидном агаре | |||
| Рост при 50 С | |||
| Рост при 420 С | |||
| Желатиназа |