Непрямой иммунофлюоресцентный метод

Метод основан на поэтапном выявлении комплексов антиген-анти­тело с помощью флюоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов при соединении бактериальных (или вирусных) антигенов со специфическими антибактериальными и противовирусными сыворотками. Второй этап - выявление этого комп­лекса путем обработки его меченым антигамма-глобулином. Иными словами, препарат, содержащий антиген (например, холерный) снача­ла обрабатывают специфической (противохолерной) сывороткой. Затем препарат обрабатывают меченой флюорохромом антиглобулиновой сы­вороткой (содержит антитела против глобулинов). Учитывая, что диагностические антибактериальные сыворотки, как правило, получа­ют путем иммунизации кроликов бактериальными антигенами, применяются люминесцирующие антиглобулиновые сыворотки, содержащие антитела к глобулинам кролика. Такую сыворотку можно получить от лошадей, иммунизированных кроличьей сывороткой.

В тех случаях, если антиген соответствует антителам специфи­ческой сыворотки, на первом этапе реакции образуется специфичес­кий комплекс антиген-антитело. При последующем добавлении антиглобулиновой сыворотки, содержащиеся в ней антитела к глобулинам кролика тоже присоединяются к этому комплексу, так как они факти­чески являются антителами антител специфической сыворотки, приме­нявшейся на первом этапе. А так как антиглобулиновая сыворотка мечена флюорохромом, образующиеся комплексы ярко светятся при люминесцентной микроскопии.

Непрямой метод сложнее в постановке, чем прямой, но зато он обладает более высокой чувствительностью. Другое его неоспоримое преимущество - он более доступен, так как с помощью одной и той же антивидовой меченой сыворотки можно выявить различные бакте­риальные антигены, применяя в каждом случае соответствующую видовую немеченую специфическую иммунную сыворотку. Так, имея на­бор немаркированных специфических иммунных сывороток кроликов к различным вирусным, бактериальным антигенам и единую меченую гамма-глобулиновую фракцию лошадиной сыворотки, можно осуществ­лять диагностику многих инфекционных заболеваний с помощью иммунофлюоресцентного метода.

Иммуноферментный анализ

В основу метода положено свойство антител соединяться с фер­ментом. Это соединение не приводит к утрате ни специфичности ан­тител, ни каталитической активности ферментов. Ферментные метки - это белковые молекулы, обладающие чрезвычайно мощным каталити­ческим действием. Ничтожно малые дозы фермента можно выявить и определить их количества по катализируемой ими реакции. В качест­ве ферментных меток наиболее часто используют: пероксидазу, щелочную фосфатазу, глюкозоксидазу. Для их выявления применяют спе­цифические субстраты (для каждого фермента есть свой субстрат). При наличии фермента субстрат изменяет свою окраску, и это регис­трируется визуально или при помощи спектрофотоколориметра. В ка­честве субстратов применяются: перекись водорода, ортодианизидин, паранитрофенилфосфат, паранитэофенил. На сегодняшний день известно большое число вариантов иммуноферментного метода. Наиболее широкое применение на практике на­шел вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Суть его в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксирован на твердом носителе, к нему последовательно добавляются другие компоненты реакций в жидкой фазе. В качестве твердых носителей используются изготовленные из синтетических инертных материалов (полистирола, дакрила, метакрила, поливинилхлорида и др.) панели, шарики, пробирки. После соединения анти­гена с антителами этот образовавшийся комплекс путем промывания можно легко отделить от несвязавшихся компонентов реакции. Метод основан на последовательном взаимодействии фиксированных на твер­дой фазе антигенов (или антител)со специфическими антителами (антигенами), а затем - и с иммуноферментными конъюгатами, пред­ставляющими собой меченые ферментом антитела против иммуноглобу­линов.

ИФА имеет следующие преимущества перед другими серологическими методами:

1) метод является универсальным, так как позволяет определить любое соединение, против которого получены специфические антите­ла;

2) меченые соединения устойчивы и сохраняют свою специфичес­кую активность при длительном хранении;

3) ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью;

4) его результаты можно оценивать визуально, без применения специальной аппаратуры.

ИФА применяется для определения как антител, так и антигенов. В зависимости от применяемой модификации ИФА различают следующие варианты методов: прямой, непрямой, конкурентный.

Прямой метод ИФА

Данный метод называют еще "сэндвич-методом". Он применяется для сероидентификации. В данном случав известным компонентом реакции, являются антитела, фиксированные на твердой фазе. Вначале в лунки, к поверхности которых фиксированы антитела (антитела-1), добавляют исследуемый антигенсодержащий материал. После опре­деленного инкубирования отмывают содержимое лунок, в результате чего несвязавшийся антиген удаляется. Затем в лунки помещают избы­ток антител, специфичных к данному антигену и меченых ферментом (антитела-2 + фермент), снова отмывают и добавляют субстрат для фермента. По истечении определенного времени останавливают реакцию внесением специфического реагента и учитывают результат визуально или по показаниям спектрофотометра. Если анализируемый антиген ока­жется специфичным по отношению к сорбированным на носителе антите­лам, то произойдет образование комплекса антитела-1 + антиген + антитела-2 + фермент; тот комплекс будет фиксирован на твердой фазе и не удалится при промываниях лунок. Для выявления фермента к сме­си добавляют субстрат, который отщепляет этот фермент, что прояв­ляется изменением окраски реагирующих смесей. Если же анализируемый антиген окажется неспецифичным по отношению к сорбированным на но­сителе антителам, то несвязавшийся антиген и меченые антитела бу­дут удалены из системы во время отмывок, и внесение субстрата не вызовет изменения окраски содержимого лунок пластиковой пластины.

Непрямой метод ИФА

Непрямой метод чаще используется для серодиагностики. В таком случае известным компонентом реакции являются антигены, фиксирован­ные на твердой фазе. В лунки вносится исследуемая сыворотка больно­го человека (неизвестные антитела). После инкубации в течение неко­торого времени, позволяющего связаться антигенам со специфическими антителами, проводится отмывка содержимого лунок. Если антигены соответствуют исследуемым антителам, образуется их соединение, и комплекс антиген-антитело оказывается фиксированным к поверхности лунок. Затем в лунки добавляют меченую ферментом антиглобулиновую сыворотку. Эти антитела специфически связываются с белками сыворотки обследуемого человека, так как являются антителами к этим белкам. Образуется так называемый "сэндвич": антигены + антитела сыворотки + антиглобулин, меченый ферментом. После очередной отмывки в лун­ки вносится субстрат, который делает реакцию видимой (изменяется цвет жидкости в лунках). Результаты реакции более точно определяют­ся фотометрически - они оцениваются по интенсивности изменения цвета среды с помощью специальных приборов - фотоколориметров.

Радиоиммунный анализ

В 1960 г. Ялод и Берсон разработали и внедрили в практику метод определения концентрации инсулина в плазме крови человека с использованием радиоактивной метки; он оказался приемлемым для количественного определения и других гормонов.

Эти исследования показали необычайно высокую чувствительность метода, позволяющего выявить незначительные количества инсулина, меченого радиоактивным йодом, по их связыванию с соответствующими антителами.

В дальнейшем предложенный радиоиммунный анализ (РИА) навел широкое применение в иммунологических исследованиях с целью выяв­ления различных по природе антигенов или антител.

Характерной особенностью радиоиммунологическйх методов явля­ется использование антигенов или антител с радиоактивной меткой. Для получения последних радиоактивные изотопы (14с, 125J, Зн, 32р и другие) вводятся в состав антигенов или антител.

На сегодняшний день существует много вариантов постановки реакции с мечеными радиоизотопами антигенами или антителами.

С целью серодиагностики возможно применение прямого варианта РИА.

Aг * I¹³⁵ + Aт →

радиоактивный стандартный исследуемая

диагностикум с известной сыворотка

радиоактивностью (R₁)

Aг * I¹³⁵ ─ Aт + Aг * I¹³⁵

комплекс надосадочная жидкость

с радиоактивностью (R₂)

Образовавшийся комплекс отделяют от оставшегося свободным меченого антигена (R₂). Затем с помощью счетчика определяют радиоактивность несвязавшегося меченого антигена. Если R₁ › R₂, реак­ция считается положительной. Разница R₁ - R₂ указывает на точное количество содержание искомого антитела.

С целью сероидентификации применяют конкурентный РИА. При этом в реакции участвуют стандартный меченый антиген и определяемый немеченый антиген, которые как бы конкурирует за места связывания специфических антител стандартной иммунной сы­воротки до наступления момента достижения равновесия всех компо­нентов реакционной смеси.

Для оценки полученных результатов отде­ляют образовавшиеся комплексы антиген-антитела (фильтрованием, центрифугированием) и с помощью счетчика определяют их радиоак­тивность. Концентрация исследуемого антигена в анализируемых про­бах устанавливается путем вычисления радиоактивности анализируе­мых проб и в контрольных образцах, где используются стандартные антигены и антитела.

1 проба:

Aг * I^{135 +} Aт → Aг * I¹³⁵ ─ Aт

меченый стандартный специфическая комплекс с радио

диагностикум иммунная сыворотка активностью (R₁)

2 проба:

Aг + Aт + Aг * I¹³⁵

исследуемый специфическая меченый стандартный

неизвестный диагностическая диагностикум

иммунная сыворотка

Aг ─ Aт ─ Aг * I¹³⁵ + Aг * I¹³⁵

комплекс с радиоактив- свободный, несвязавшийся,

ностью (R₂) отмывается

Образовавшиеся комплексы отделяют от свободного, оставшего­ся несвязанным меченого антигена. Затем с помощью счетчика опре­деляют и сравнивают радиоактивности образовавшихся комплексов R₁ и R₂ .Если R₁ › R₂ - реакция считается положительной. Разница R₁ - R₂ указывает на точное количественное содержание искомого антигена.

Недостатки ИФА - сложности, связанные с получением высокоочищенных антигенов и с необходимостью создания безопасных условий при работе с радиоактивными веществами.

Иммуноблотинг

Иммуноблотинг - метод идентификации антигенов или антител сочетающий в себе:

а) электрофоретическое разделение сложной смеси биологических макромолекул (антигенов или антител) с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;

б) перенос разделенных белковых макромолекул из геля на твердую подложку (агарозу, диазобумагу, нитроцеллюлёзный фильтр);

в) выявление на твердой подложке перенесенных белков с по­мощью ИФА, РИА, РИФ.

Данный метод позволяет получать результаты, отличающиеся вы­соким качеством с точки зрения разрешающей способности, чувстви­тельности и достоверности.

Приведенные данные свидетельствует о большом разнообразии серо­логических методов исследования, применяемых при диагностике бакте­риальных инфекции. Значение этих методов для практической медицины трудно переоценить. Возможности серологии чрезвычайно велики. Серологические реак­ции помогают установить этиологию заболеваний, изучить патогенез, позволяют проследить какой путь проходят возбудители в организме больного и какова динамика накопления специфических антител; они с успехом применяются для решения важнейших практических задач профлактики и терапии многих заболеваний

.