Ход микробиологического исследования. Идентификация энтеробактерий начинается с изучения их колоний на пластинчатых средах
Первый день.
Идентификация энтеробактерий начинается с изучения их колоний на пластинчатых средах. Для целей клинической микробиологии это, в первую очередь, среды Эндо или ЭМС-агар (с эозин - метиленовым синим), обладающие дифференциально - диагностическими свойствами. При исследовании кишечного содержимого могут быть использованы дополнительно среды Плоскирева, висмут - сульфитный агар, слабощелочной и кровяной агар.
На среде Эндо колонии представителей семейства Enterobacteriaceae обычно выпуклые с правильными очертаниями (круга), более или менее опалесцирующие, иногда слизистые. Они могут быть окрашены в красный цвет с наличием металлического блеска или без него (лактозоположительные энтеробактерии), бесцветными (лактозоотрицательные), могут приобретать розоватый или сероватый оттенок с более или менее выраженным темным центром, особенно у более крупных колоний.
Диаметр и окраска колоний могут варьировать не только в зависимости от родовой принадлежности, но и от массивности роста. В среднем диаметр колоний составляет 1-2 мм, мелкие бесцветные колонии - росинки - характерны в 1 сутки роста для иерсиний (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis), такие чашки необходимо дополнительно инкубировать при комнатной температуре еще 18-20 часов.
P. vulgaris и P. mirabilis обычно дают вуалеобразный рост ("роение"), а представители родов Klebsiella и Enterobacter чаще образуют сочные слизистые розовые колонии диаметром 2-3 мм. Шигеллы, сальмонеллы, гафнии, нероящиеся представители рода протеев обычно образуют более "нежные" колонии небольших размеров. Часть штаммов серраций дает розово - красные, с фуксиновым оттенком пигментированные колонии.
Намеченные для дальнейшего изучения колонии снимают бактериологической петлей (или иглой) и засевают штрихом по косяку и уколом в столбик комбинированной среды для первичной идентификации. Наиболее принятыми являются среды Клиглера, Олькеницкого и их модификации. Эти двух (лактоза, глюкоза) и трех- (лактоза, глюкоза, сахароза) сахарные среды, включающие для выявления образования сероводорода: аммоний - железо (II) - сульфат (соль Мора), натрий тиосульфат (гипосульфит) и мочевину, позволяют после 18-20-часовой инкубации их при 370 С составить предварительное заключение о возможной родовой принадлежности выделенных культур и определить набор необходимых тестов для идентификации рода и вида.
Для иерсиний дополнительная и параллельная инкубация посевов при комнатной температуре обеспечивает более четкое проявление биохимических реакций.
Второй день.
Учет результатов посева в среду для первичной идентификации.
Микроскопия окрашенных по Граму мазков.
Микробы семейства Enterobacteriaceae дают на поверхности скошенной части среды Клиглера, Олькеницкого (или модификации) влажный, однородный, опалесцирующий рост без пигментообразования (за исключением представителей рода Serratia).
Ферментация глюкозы - облигатное свойство всех энтеробактерий - проявляется в изменении окраски столбика среды (цвет зависит от используемого в среде индикатора, а также интенсивности кислотообразования).
При наличии в составе среды мочевины (среда Олькеницкого и ее модификации) окраска столбика среды не меняется в случаях выделения энтеробактерий, гидролизующих мочевину (многие представители родов Citrobacter, Klebsiella, Proteus, вида Е. cloacae, кроме P. inconstans, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, иногда S. marcescens). В этих случаях кислые продукты ферментации глюкозы нейтрализуются щелочными продуктами гидролиза мочевины.
Особенности гидролиза мочевины клебсиеллами и иерсиниями не всегда позволяют выявить этот признак при включении мочевины в комбинированную среду. Более надежным для них является определение уреазной активности в средах с мочевиной по Кристенсену или по Преусу, для чего параллельно с посевом в комбинированную среду делают посев в пробирку со средой Кристенсена.
Неизменная окраска столбика среды, не содержащей мочевины (среда Клиглера), свидетельствует о выделении микробов, не относящихся к семейству Enterobacteriaceae . Для подтверждения такого заключения используют тест на цитохромоксидазу (отрицательный у энтеробактерий), а при необходимости и другие в соответствии с "Определителем Берги".
Кроме кислотообразования, по наличию разрывов (отслаиванию среды от стенок или дна пробирки) в столбике комбинированной среды судят об образовании при ферментации глюкозы газообразных продуктов (газообразование характерно для большинства эшерихий, эдвардсиелл, цитробактеров, подавляющего большинства сальмонелл, представителей трибы клебсиелл, отдельных видов протея).
Почернение среды, появляющееся в средней или нижней части столбика, происходит при образовании выделенным микробом сероводорода, что свойственно, представителям рода Salmonella, видов С. freundii, Р. vulgaris, Р. mirabilis, Edwardsiella и некоторым представителям рода Erwinia.
Способность ферментировать лактозу (а в трех - сахарной среде и сахарозу) оценивают по изменению окраски скошенной части комбинированной среды. Обычно лактозоположительными бывают представители родов Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter. Ферментация лактозы нередко коррелирует с ферментацией сахарозы. В неясных случаях следует проверить эти свойства путем посева культур в среды Гисса с соответствующими углеводами.
Таким образом, через 18-20 часов инкубации посева в комбинированную среду и одновременно в среду с мочевиной по Кристенсену или по Преусу возможен учет 4-5 признаков, характеризующих выделенную культуру, что позволяет значительно сузить диапазон подозреваемых родовых групп.
Сходное сочетание биохимических реакций (отношение к лактозе, глюкозе, мочевине, образование сероводорода) может наблюдаться одновременно у нескольких родовых групп семейства Enterobacteriaceae, и для их дифференциации необходимо использовать дополнительные тесты, минимально необходимые для установления родовой, а, в ряде случаев, и видовой принадлежности. Известно немало рекомендаций по составу таких минимальных наборов дифференциальных тестов для определения рода в семействе Enterobacteriaceae. В таблице 13 (нижняя часть) представлены тесты, наиболее остро необходимые и относительно более доступные практическим бактериологическим лабораториям.
Таблица 13
Дифференциация родовых групп Enterobacteriaceae по биохимическим свойствам при использовании минимального дифференцирующего ряда
| Тест или субстрат | Escherichia | Shigella | Salmonella | Citrobacter | Klebsiella | Enterobacter | Hafnia | Serratia | Proteus | Yersinia | Edwardsiella | Erwinia | |
| Комбиниро-ванная среда | Сероводород | - | - | +,- | +,- | - | - | - | - | +,- | - | + | -,+ |
| Лактоза | +,- | - | -,+ | х | + | + | -,+ | -,+ | - | - | - | х | |
| Глюкоза (газ) | +,- | - | +,- | + | + | + | +,- | -,+ | +,- | - | + | - | |
| Мочевина | - | - | - | х | - | (+),- | - | х | +,- | +,(+) | - | - | |
| Минимальный дифференцирующий ряд | Мочевина (по Преусу или Кристенсену) | - | - | - | х | (+),+ | (+),- | - | х | +,- | + | - | - |
| Подвижность | +,- | - | +,- | + | - | + | х | + | +,- | - | + | + | |
| Индол | +,- | -,+ | - | -,+ | -,+ | - | - | - | +,- | х | + | - | |
| Фенилаланиндезаминаза | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | х | |
| Цитрат Симонса | - | - | +,- | + | + | + | х | + | х | - | - | + | |
| Ацетат натрия | +,(+) | - | х | х | + | + | -,(+) | х | х | х | х | х | |
| Лизиндекарбоксилаза | +,- | - | +,- | - | + | -,+ | + | + | - | - | + | - | |
| Орнитиндекарбоксилаза | х | -,+ | + | х | - | + | + | + | -,+ | х | + | - | |
| Среда Кларка | реакция с метиловым красным | + | + | + | + | -,+ | - | + | х | + | + | + | - |
| реакция Фогеса-Проскауэра | - | - | - | - | +,- | - | + | х | + | + | + | - | |
| Сорбит | х | х | + | + | + | + | - | + | -,+ | х | - | х |
Примечание. Условные обозначения: «+» - положительная реакция; «-» - отрицательная реакция; «+,(+)» - чаще положительная, реже замедленно положительная реакция; «-,(+)» - чаще отрицательная, реже замедленно положительная реакция; «-,+» - чаще отрицательная, реже положительная реакция; «+,-» - чаще положительная, реже отрицательная реакция; «(+),+» - чаще замедленно положительная, реже положительная реакция; «(+),-» - чаще замедленно положительная, реже отрицательная реакция; «х» - различные результаты реакции.
Второй день завершают посевами на среды минимального дифференцирующего ряда и скошенный питательный агар (таблица 13).
Посев в среду с мочевиной по Кристенсену или по Преусу не повторяют, если он был сделан на этапе отбора колоний.
Для большей четкости и надежности результатов полезно учитывать следующее:
а) при "скашивании" среды Кристенсена с мочевиной высота столбика должна превышать длину скошенной части. Посев делают штрихом по скошенной части. С культурами протеев (кроме P. inconstans) положительные результаты могут быть получены в течение дня, но окончательный учет производят через 18-24 часа;
б) для определения индола используют индикаторные бумажки, пропитанные реактивом Эрлиха или Ковача;
в) для воспроизведения тестов с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра кроме классического метода с жидкой средой Кларка можно использовать полужидкую среду Кларка, что позволит в этой же пробирке определить подвижность изучаемого микроба;
г) при испытании подвижности культуры в полужидком агаре следует делать укол петлей на глубину 1-1,5 см, а не до дна пробирки;
д) при выделении лактозоотрицательных, безгазовых культур, не образующих сероводород и не гидролизующих мочевину, к числу дополнительных родовых тестов следует добавить ацетатный (или цитратный по Кристенсену) для более надежной дифференциации шигелл (не растущих на ацетатной среде и цитратной среде Кристенсена) от эшерихий, вырастающих обычно на первые, иногда вторые сутки.
Третий день.
Проводится регистрация результатов испытываемой культуры в минимальном ряду тестов. В соответствии с таблицей 13 делают заключение о родовой принадлежности выделенной культуры.
В клинической микробиологии идентификация энтеробактерий завершается обычно определением рода и вида выделенной культуры и, лишь при наличии эпидемиологических показаний, и иногда для утверждения этиологической значимости, она дополняется определением биоваров (по старой терминологии биотипов), а в некоторых родовых группах условно патогенных энтеробактерий - определением сероваров (по старому серотипов) (Escherichia, Citrobacter, Р. vulgaris, Р. mirabilis). Определение рода и вида энтеробактерий основывается на изучении совокупности биохимических тестов. Попытки пренебрегать определением минимального ряда родовых биохимических тестов неизбежно влекут за собой ошибочную диагностику, исключают возможность выявления всего многообразия условно - патогенных энтеробактерий, связываемых в настоящее время с патологией у человека.
Определение по минимальному набору тестов родов Esherichia, Edwardsiella, Hafnia, Serratia (включающих, согласно "Краткого определителя бактерий Берги", по одному виду) позволяет одновременно делать заключение о выделении соответствующих видов E. coli, E. tarda, H. alvei или S. marcescens.
Наличие фуксиновокрасного или розового пигмента может подтверждать принадлежность выделенной культуры к виду S. marcescens, но отсутствие пигмента не исключает такого заключения.
Если по предварительным данным не исключена принадлежность культуры к родам Hafnia или Yersinia, целесообразно сделать посев в 2 пробирки со средой Кларка, одну из которых оставить до следующего дня при комнатной температуре, а другую - при 37 град. С, с последующим воспроизведением тестов с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра (см. табл. 13). Дополнительным признаком в пользу выделения Hafnia может быть особенно бурное (в сравнении с другими энтеробактериями) выделение кислорода в пробе с 3% Н2О2 на предметном стекле (тест на каталазу).
На III день идентификации культуры, отнесенные по данным учета минимального ряда к родам Salmonella, Citrobakter, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Yersinia подвергают дальнейшему изучению с целью определения вида (подрода).
При внутриродовой дифференциации требуются различные наборы биохимических тестов для разных родов. Соответствующие сведения приведены в таблице 14.
Таблица 14
Расширенная характеристика биохимических свойств родовых групп Enterobacteriaceae
| Тест или субстрат | Escherichia | Shigella | Salmonella | Citrobacter | Edwardsiella | Klebsiella | Enterobacter | Hafnia | Serratia | Proteus | Yersinia | Erwinia |
| Цитрат Симонса | - | - | +,- | + | - | + | + | х (370С) + (220С) | + | х | - | + |
| Мочевина | - | - | - | х | - | (+),+ | (+),- | - | х | +,- | + | - |
| Малонат натрия | - | - | -,+ | -,+ | - | + | +,- | х | - | - | - | х |
| Фенилаланиндезаминаза | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | х |
| Сероводород | - | - | +,- | +,- | + | - | - | - | - | +,- | - | + |
| Подвижность | +,- | - | +,- | + | + | - | + | х (370С) + (220С) | + | +,- | -(370С) + (220С) | +,- |
| Индол | +,- | -,+ | - | -,+ | + | -,+ | - | - | - | +,- | - | - |
| Реакция с метиловым красным | + | + | + | + | + | -,+ | - | + (370С) - (220С) | + (370С) | + | + | - |
| реакция Фогеса-Проскауэра | - | - | - | - | - | +,- | + | х (370С) + (220С) | х (370С) | - | - | х |
| Лизиндекарбоксилаза | +,- | - | +,- | - | + | + | -,+ | + | + | - | - | - |
| Аргининдигидролаза | х | -,+ | (+),+ | х | - | - | +,- | - | - | - | - | - |
| Орнитиндекарбоксилаза | х | -,+ | - | х | + | - | + | + | + | -,+ | х | - |
| Глютаминовая кислота | + | + | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - |
| Желатин | - | - | -,(+) | - | - | - | -,(+) | - | + | х | - | + |
| КСN | - | - | -,(+) | + | - | + | + | + | + | + | - | х |
| Ацетат натрия | +,(+) | - | х | х | х | + | + | -,(+) | х | х | х | х |
| Цитрат Кристенсена | х | - | + | + | + | + | + | + | + | х | . | . |
| Целлобиоза | - | - | х | х | - | + | + | х | х | х | + | х |
| Газообразование из глюкозы | +,- | -,+ | +,- | + | + | + | + | х | х | х | - | - |
| Адонит | -,+ | - | - | - | - | + | х | - | х | -,+ | х | - |
| Арабиноза | х | х | + | + | - | + | + | + | - | - | х | + |
| Глицерин | + | х | + | + | . | + | -,+ | + | + | + | . | х |
| Дульцит | х | х | +,- | х | - | -,+ | х | - | - | - | - | - |
| Инозит | -,+ | - | х | -,+ | - | + | -,+ | - | х | -,+ | х | |
| Ксилоза | х | х | х | + | . | + | + | + | х | +,- | х | х |
| Лактоза | х | -,(+) | -,+ | х | - | + | + | х | -,+ | - | - | х |
| Мальтоза | х | х | + | + | . | + | + | + | + | +,- | + | + |
| Маннит | + | +,- | + | + | - | + | + | + | + | -,+ | + | + |
| Рамноза | х | х | х | + | - | + | + | + | - | х | +,- | + |
| Раффиноза | х | х | -,+ | х | - | + | + | - | - | - | - | . |
| Салицин | х | - | - | х | - | + | х | х | + | х | +,- | х |
| Сахароза | х | - | - | + | - | + | + | х | + | х | -,+ | х |
| Сорбит | х | х | + | + | - | + | + | - | + | -,+ | х | х |
Примечание. Приведены свойства, характерные для К.pneumoniae, Еrwinia herbicola, рода Yersinia за исключением Y.pestis.
Условные обозначения: «.» - не изучено; «+» - положительная реакция; «-» - отрицательная реакция; «+,(+)» - чаще положительная, реже замедленно положительная реакция; «-,(+)» - чаще отрицательная, реже замедленно положительная реакция; «-,+» - чаще отрицательная, реже положительная реакция; «+,-» - чаще положительная, реже отрицательная реакция; «(+),+» - чаще замедленно положительная, реже положительная реакция; «(+),-» - чаще замедленно положительная, реже отрицательная реакция; «х» - различные результаты реакции.
В связи с неразработанностью внутривидовой идентификации Erwinia ответ ограничивают определением группы Herbicola (см. табл. 13).
При наличии показаний и возможностей в этот же день культуры, отнесенные к родам Shigella, Salmonella, Citrobakter, Proteus, Eseherichia, испытывают в реакциях агглютинации с родовыми и групповыми агглютинирующими сыворотками согласно существующим наставлениям.
Для серологического изучения используют суточные культуры на скошенном питательном агаре, засеваемом одновременно с посевами на минимальный ряд родовых тестов. (2 день идентификации).
Четвертый день.
Учет результатов внутриродовой дифференциации (табл. 14). Выдача ответа.