Компоненты питательных сред для микроорганизмов и их назначение

Морфологические методы.

Это классическое направление исследований. Позволяют выявить характерные морфологические структуры возбудителя непосредственно в кли­ническом материале, путем приготовления мазков окрашенных простыми или сложными методами. Наиболее распространенной методикой окраски является окраска по Граму, что позволяет судить о строении клеточной стенки микроорганизмов. Окраска по Нейссеру позволяет выявить специфические метахроматические включения волютина, по Цилю-Нильсону – кислотоустойчивые бактерии, по Ожешки- споры.

Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют обнаружить специфическую подвижность возбудителей.

Люминисцентная микроскопия используется как метод экспресс-диагностики.

Культуральный метод

Основной недостаток классического метода длительность исследования. Так, по быстрорастущим микробам результат может быть получен не ранее, чем через 2-3 суток после посева на плотную среду. Для ускоренной идентификации выделяемых культур в состав сред для первичного посева или накопления чистой культуры обычно вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В классическом варианте это углеводы (лактоза, сорбит, сахароза и т. д.), мочевина пли другие субстраты, при расщеплении которых микробными ферментами образуются вещества, изменяющие рН или окислительно-восстановительный потенциал среды. В результате появления продуктов ферментации индикатор окрашивает, например, колонии микробов и среду вокруг, помогая отличить их от бесцветных (неокрашенных) колоний микробов, не ферментирующих данный субстрат. Дифференциация при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителен разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных сред. Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты.

Автоматические/полуавтоматические системы

Наряду с бесспорными преимущест­вами использования подобных систем, имеют место существенные не­достатки, не позволяющие использовать их как альтернативные сред­ства идентификации.

Цифровое кодирование. Полученный образ неизвестной культуры может быть представлен в виде цифрового кода, который и вводится в компьютер. Каждая цифра кода соответствует определенным результатам трех тестов.

Использование "хромогенных" питательных сред

В конце XX века в бактериологическую практику вошли дифференциальные среды нового поколения хромогенные, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов.

К таким ферментам относятся, например, /J-D-глюкуронидаза Escherichia coli или /S-D-глюкозидаза энтерококков. Для обнаружения уникального фермента и, соответственно, идентификации микроорганизма, в состав среды вводят хромогенный субстрат вещество, при расщеплении которого этим ферментом образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате микробный рост окрашивается в определенный цвет или приобретает способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав сред (в том числе селективных) для первичного посева, то результат выделение чистой культуры и ее идентификация может быть получен уже в течение первых суток исследования. Иногда при этом требуется проведение быстрых подтверждающих тестов (например, капельный тест на индол с реактивом Ковача для Е coli).

Хромогенная реакция на изучении энзиматического профиля, протекает в течение нескольких часов.

Важным компонентом микробиологического исследования является оценка чувствительности к антимикробным химиопрепаратам.

Колицинотипирование

В питательный агар в чашки патри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37 °С втечениe суток, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного 1 мл 4-часовой бульонной культуры Е. coli неизвестного колициногенотипа (например, Col A, Col В и др.)- Через 18—24 ч отмечают результаты опыта по наличию или отсутствию роста. Исследуемая и индикаторная культуры имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат идентичные Col-плазмиды. В противном случае вокруг эталонных штаммов появляются прозрачные зоны подавления роста бактерий.

Морфологические методы.

Это классическое направление исследований. Позволяют выявить характерные морфологические структуры возбудителя непосредственно в кли­ническом материале, путем приготовления мазков окрашенных простыми или сложными методами. Наиболее распространенной методикой окраски является окраска по Граму, что позволяет судить о строении клеточной стенки микроорганизмов. Окраска по Нейссеру позволяет выявить специфические метахроматические включения волютина, по Цилю-Нильсону – кислотоустойчивые бактерии, по Ожешки- споры.

Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют обнаружить специфическую подвижность возбудителей.

Люминисцентная микроскопия используется как метод экспресс-диагностики.

Культуральный метод

Основной недостаток классического метода длительность исследования. Так, по быстрорастущим микробам результат может быть получен не ранее, чем через 2-3 суток после посева на плотную среду. Для ускоренной идентификации выделяемых культур в состав сред для первичного посева или накопления чистой культуры обычно вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В классическом варианте это углеводы (лактоза, сорбит, сахароза и т. д.), мочевина пли другие субстраты, при расщеплении которых микробными ферментами образуются вещества, изменяющие рН или окислительно-восстановительный потенциал среды. В результате появления продуктов ферментации индикатор окрашивает, например, колонии микробов и среду вокруг, помогая отличить их от бесцветных (неокрашенных) колоний микробов, не ферментирующих данный субстрат. Дифференциация при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителен разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных сред. Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты.

Компоненты питательных сред для микроорганизмов и их назначение

Компоненты питательных сред для микроорганизмов и их назначение
Ингредиент	Назначение
Агар-агар	а) придание плотной (1 -2%1 или полужидкой (0,3-0,7%) консистенции; б) в концентрации 0,05-0,10% используют для снижения парциального давления кислорода в бульонах
Акрифлавин	селективное подавление Гр+ микроорганизмов;
Альбумин	защита от токсических метаболитов, связывает свободные жирные кислоты;
Антибиотики	подавляя рост тех или иных микробов, придают среде селективные свойства;
N-2-ацет-амид-2-аминоэтан-сульфоновая кислота	в отличие от неорганических веществ, обладающих рН-буферными свойствами, не подавляет рост бактерий;

Глюкоза	а) источник энергии; б) дифференцирующий субстрат; в) повышение осмотиче­ского давления (гипертонические среды);
Глицерин	богатый источник углерода; используют в средах для транспортировки, хране­ния и культивирования;
Глицин	подавляя рост микробов, придает среде селективные свойства;
Дрожжевой экс­тракт	водорастворимый источник витаминов группы В и белков;
Железа аммоний­ного цитрат	используют в сочетании с некоторыми дифференцирующими субстратами (тио­сульфатом натрия, эскулином), т.к. продукты их разложения образуют при соединении с железом черный осадок;
Желчь	подавляя рост некоторых микробов, придает среде селективные свойства;
Крахмал	а) детоксикация; б) дифференцирующий субстрат;
Уголь (активиро­ванный)	а) детоксикация; б) удаление перекисей и радикалов; в) изменение поверхност­ного натяжения;

Пробирочные тесты исследования биохимической активности микроорганизмов, несмотря на широкое использование миниатюризированных систем идентификации (СИБы и др.), сохраняют свое значение и в настоящее время. Биохимические тесты надежны, но нередко трудоемки и требуют больших временных затрат. Их применение позволяет проводить верификацию анализа как в референтных, больших, так и в небольших лабораториях, причем круг идентифицируемых микроорганизмов довольно широк.

Особое значение имеют верификационные исследования с применением пробирочных тестов при внедрении и в период эксплуатации других тест-систем для идентификации, при анализе деятельности лабораторий и отдельных специалистов (в ходе лицензирования и сертификации).

В настоящее время наряду с классическими пробирочными методами разработаны и широко используются автоматизирование cистемы идентификации, а также специальные коммерческие наборы для ускоренной идентификации.

В последнее время широко используют "хромогенные" питательные среды, позволяющие уже на первом этапе микробиологического исследования, через 24 часов получить видовое название возбудителей. Такие хромогенные питательные среды разработаны, как для бактериальных культур, так и микроскопических грибов.

Из современных методов важное место имеет газожидкостная хроматография – не иммунологический метод диагностики, позволяющий обнаружить не только составные части клеточной стенки возбудителей в исследуемом материале, но и специфичные для данной группы микроорганизмов метаболитов.

Рассмотрим примеры таких ускоренных систем идентификации