Работа № 2. Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки

Цель:изучить строение бактериальной клетки и структуру клеточной стенки бактерий; освоить технику приготовления фиксированных препаратов.

Самостоятельная работа:приготовить мазок из смеси культур стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму (см. теоретическую справку). Оценить морфологические и тинкториальные свойства.

Работа № 2. Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки - student2.ru Результат:

Вывод:

Работа № 3.Техника приготовления препаратов для изучения живой культуры (нативные препараты). Изучение подвижности микроорганизмов.

Самостоятельная работа: по характеру движения микроорганизмов определить расположение жгутиков

Работа № 2. Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки - student2.ru

Препараты

«висячая» капля «раздавленная» капля

Вывод (о необходимости изучения подвижности микроорганизмов):

Подпись преподавателя_________________________________________________________

К работе № 2 Теоретическая справка

Структурные компоненты бактериальной клетки, их функции методы выявления:

Постоянные компоненты и их природа	Функции	Метод выявления
Клеточная стенка Гр + (пептидогликан, тейхоевые кислоты) Гр – (пептидогликан, фосфолипиды, белки, ЛПС)	1) Скелетная 2) Защитная 3) Рецепторная 4) Антигенная 5) Адгезивная 6) Транспортная 7) Нарушение синтеза клеточной стенки ведет к образованию L-форм	Световая микроскопия, окраска по Граму
ЦПМ (цитоплазматическая мембрана) Двойной слой фосфолипидов с внедрёнными белками	1) Основной осмотический барьер 2) Участвует в регуляции роста и синтезе компонентов клеточной стенки 3) Транспорт питательных веществ в клетку и метаболитов из нее 4) Инвагинации участков ЦПМ - мезосомы- содержат ферменты, обеспечивающие биологическое окисление	Электронная микроскопия
Мезосомы Производные ЦПМ	1) Аналог митохондрий, обеспечивают синтез АТФ и процессы дыхания 2) Участвуют в делении клетки 3) Участвуют в спорообразовании	Электронная микроскопия
Цитоплазма Сложная коллоидная система, состоит из воды, растворимых белков, РНК	Обеспечивает функционирование всех органелл	Электронная микроскопия
Рибосомы 70S	Отвечают за биосинтез белка	Электронная микроскопия
Нуклеоид Двунитевая молекула ДНК, замкнута в кольцо, плотно уложена в виде клубка	Расположен в центральной зоне бактерий (одна хромосома) – носитель генетической информации	Электронная микроскопия

Непостоянные компоненты и их природа	Функции	Метод выявления
Капсула Слизистая структура, прочно связана с клеточной стенкой (полисахариды или полипептиды)	1) Защитная 2) Антигенная 3) Адгезивная	Световая микроскопия, окраска по Бурри, Бурри-Гинсу
Жгутики Состоят из белка-флагеллина, являющимся Н-антигеном Пили Состоят из белка	Обеспечивают движение бактерий Пили 1-го порядка обеспечивают адгезию на поражаемой микробной клетке. Пили 2го порядка – конъюгационные, обеспечивают перенос части генетического материала от донора к реципиенту	В мазках «висячая капля», «раздавленная капля», при фазово-контрастной микроскопии Электронная микроскопия
Плазмиды Дополнительные факторы наследственности в виде замкнутых колец ДНК с небольшой молекулярной массой	1) Регуляторная – компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина 2) Кодирующая – внесение в бактериальную клетку новой генетической информации	Электронная микроскопия
Включения Гликоген, полисахариды, бета-оксимасляная кислота, полифосфаты (волютин)	Запас питательных веществ	Световая микроскопия. Волютин окрашивают по Леффлеру или Нейссеру
Спора Образуют Гр+ бактерии, из одной клетки образуется спора. Плотная многослойная оболочка, с большим содержанием кальция и липидов, низким содержанием воды	Сохранение генетической информации, при неблагоприятных условиях. Расположена: - субтерминально - терминально - центрально	Световая микроскопия, окраска по Ожешко.

Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.

1 этап.Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.

2 этап.Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество материала, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см².

3 этап. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. В фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы фиксации

Физический метод	Химический метод
Фиксация мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх	Мазок погружают в фиксатор на определенное время. В качестве фиксатора используют: этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь Никифорова (этанол +эфир – 1:1) – 10-15 мин и др.

Методы окраски

Простые методы (ориентировочные)	Сложные методы (дифференцирующие)
1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним красителем анилино-вого ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый.	1. Применяют для изучения структуры клеток, дифференциации микроорганизмов. 2. Используют несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, НейссераГинса-Бурри и др.

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион - катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Окраска поГраму. Сущность метода

Метод основан на способностимикроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. Уграмположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Этапы окраски по Граму представлены на стенде.

Окраска по Цилю-Нильсену.

Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии за счет содержания указанных веществ прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя - метиленового синего – окрашиваются в синий свет.

Методика окраски по Цилю-Нильсену:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Окраска по Ожешко

Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет.

Методика окраски по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы- синий.

Окраска по Романовского-Гимза.

Методика окраски по Романовскому-Гимза:

Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

К работе № 3 Теоретическая справка

Исследование микроорганизмов в живом состоянии для изучения форм и подвижности.

Техника приготовления препаратов «висячая» и «раздавленная» капли

1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.

2 этап.

Препарат «раздавленная» капля

Препарат «висячая» капля

Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество мате-риала для исследования. Затем на каплю накла-дывают покровное стекло таким образом, чтобы между ним и предметным стеклом не было пузырьков воздуха. Если культура выращена на жидкой питатель-ной среде, то для приготовления препарата используют пастеровскую пипетку, с помощью которой каплю культуры наносят на предметное стекло.

Препарат готовят аналогичным образом, но каплю культуры наносят на покровное стекло, которое затем накладывают на предметное стекло с лункой, края которой смазаны вазели-ном. Стекла склеиваются и получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

Самостоятельная работа во внеурочное время

1. Дайте определение:

а) морфологические свойства - __________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________б) тинкториальные свойства - ____________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Подписать постоянные и непостоянные компоненты бактериальной клетки (постоянные - синим, непостоянные - красным)

Схема строения бактериальной клетки:

Работа № 2. Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки - student2.ru

3. Дать характеристику перечисленных структурных компонентов бактериальной клетки, методы их выявления, охарактеризовать участие в процессах метаболизма и значение структур для процессов репродукции, биосинтеза белка, энергетической, регуляторной, адгезивной функциях клетки.