Схема цикла амплификации (многократного увеличения числа копий специфического
Фрагмента участка ДНК)
1. Денатурация (разрыв водородных связей и трансформация двухцепочечной ДНК в одноцепочечные) осуществляется при температуре 93-95ºC в течение 1-3 минут
2. Присоединение (отжиг) праймеров (олигонуклеоитидные генетические затравки) происходит комплементарно к соответствующим последовательностям специфического фрагмента на противоположных нитях ДНК. Температура отжига является специфической для каждой пары праймеров и располагается в интервале 50-65 ºC. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная величина температуры отжига праймеров является одной из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплементарным последовательностям.
3. Комплементарное достраивание цепей ДНК (синтез фрагмента). Присоединившиеся праймеры формируют стартовые блоки, с которых начинается синтез ДНК. Комплементарное достраивание нитей ДНК всегда протекает только в направлении от 5'-конца к 3'- концу нити ДНК и происходит в противоположных друг другу направлениях. Образовавшиеся в первом цикле амплификации продукты синтеза служат матрицами для второго цикла амплификации, в результате которого, собственно, и происходит накопление искомого специфического фрагмента ДНК. Начиная с третьего цикла амплификации вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция в ПЦР. Температура синтеза ДНК 72 ºC, время -3 мин.
Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) осуществляет термостабильная ДНК-полимераза, т.н. Taq-полимераза в присутствии ионов магния и трис- HCl – буфера, которые создают необходимые условия для функционирования фермента.
В результате 30-45 циклов амплификации синтезируются 108 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агаровом (полиакриламидном) геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером или амплификатором. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.
Занятие № 3
Тема: Бактериофагия.
Цель занятия: знатьстроение бактериофагов, этапы взаимодействия вирулентного и умеренного фага с бактериальной клеткой, цели использования бактериофагов в медицине и генетике.
уметь учитывать результаты: фаголизабельности по методу Отто, определения титра бактериофага по методу Грациа, определения фаготипа и фагогруппы стафилококка
1. Вопросы для самоподготовки:
1. Особенности строения бактериофагов
2. Репродукция и этапы взаимодействия вирулентного бактериофага с бактерией
3. Репродукция и этапы взаимодействия умеренного бактериофага с бактерией
4. Применение бактериофагов в медицине и генной инженерии
2. Контрольные вопросы:
1) Перечислить основные формы бактериофагов _____________________________
_____________________________________________________________________________
2) Перечислить основные этапы взаимодействия вирулентного бактериофага с бактерией
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1) Перечислить основные этапы взаимодействия умеренного бактериофага с бактерией
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2) Выписать определения понятий:
а) профаг _________________________________________________________________________
б) лизогения __________________________________________________________________
в) лизогенные бактерии _________________________________________________________
г) фаговая конверсия___________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
3) Перечислить диагностические и лечебно-профилактические бактериофаги
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4) Дать определения:
Трансформация – ______________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Коньюгация – ________________________________________________________________
Трансдукция – _______________________________________________________________
5. Заполнить таблицу «Сравнительная характеристика бактериофагов».
| Вирулентные фаги | Умеренные фаги |
Базовый текст
1. Особенности строения бактериофагов
Бактериофаги (от бактерия и греч. phagos - пожирающий) - вирусы бактерий, специфически проникающие в бактерии и паразитирующие в них вплоть до гибели (лизиса) бактериальные клетки. В 1915 г. французский микробиолог Д'Эррель, наблюдал лизис бактериальной культуры дизентерии. Д'Эррель сделал заключение, что открытый им литический агент является вирусом бактерий, и назвал его «бактериофагом»- пожирателем бактерий.
Бактериофагишироко распространены в природе – их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. Они выявлены у большинства бактерий, а также у других микроорганизмов, например у грибов. Поэтому бактериофаги в широком смысле слова часто называют просто фагами.
Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к общепринятой систематике вирусов. В основу классификации положены антигенная структура, морфологические свойства, спектр действия, тип взаимодействия с клеткой и др. Бактериофаги принято обозначать буквами латинского, греческого или русского алфавита, часто с цифровым индексом перед которыми стоит название вида бактерий (например, фаги E.coli T2). Для обозначения группы родственных фагов используют родовые и видовые названия микробов, из которых выделены соответствующие фаги: колифаги, стафилофаги, актинофаги, микофаги и т.д. Вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Размножение и выход дочерних популяций вируса из бактерии сопровождается ее гибелью и разрушением (лизисом). По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов.
Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°- 70°С. Переносят замораживание и длительно сохраняются при низких температурах и высушивании. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация также вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах - мутации.
Строение бактериофагов изучают с помощью электронной микроскопии. Большинство фагов относится к ДНК-содержащим вирусам с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. Размер бактериофагов колеблется от 20 до 800 нм (у нитевидных форм). Бактериофаги (фаги) содержат ДНК или РНК. Наиболее изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида и сокращающийся чехол отростка, например, колифаги Т2, Т4, Т6. Они достигают длины до 200 нм и состоят из хвостового отростка, головки в форме многоранника, содержащей нуклеиновую кислоту. У фагов, имеющих форму сперматозоида, одна молекула двунитевой суперспирализованной ДНК находится внутри головки и защищена капсидом. Капсид головки и чехол хвостового отростка бактериофага состоят из полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (головка) или спиральному (отросток) типу симметрии. Хвостовой отросток имеет внутри трубку (стержень), сообщающуюся с головкой, а снаружи - чехол отростка, способный к сокращению, наподобие мышцы и заканчивающийся шестиугольной базальной пластинкой с шипами, от которых отходят фибриллы (нити).
В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на несколько морфологических типов (таблица 38).
Таблица 38. Морфологические типы бактериофагов
| I тип | нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду |
| II тип | Представлены головкой и рудиментом хвоста; геном большинства представлен молекулой РНК, за исключением фага jc-174 с однонитевой геномной ДНК |
| III тип | это фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком |
| IV тип | фаги с несокращающимся чехлом отростка и двунитевой ДНК (Т1, Т5 и др.) |
| V тип | ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой (Т2, Т4, Т6) |
2. Репродукция и этапы взаимодействия вирулентного бактериофага с бактерией
Вирулентные бактериофаги, попав в бактерию, реплицируются, формируя 200-300 фаговых частиц, и вызывают гибель (лизис) бактерии. Это продуктивный тип взаимодействия. Бактериофаги с сокращающимся чехлом адсорбируются на клеточной стенке с помощью фибрилл хвостового отростка. Чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помощью ферментов (лизоцима) как бы просверливает оболочку клетки. Через канал трубки бактериофага нуклеиновая кислота инъецируется из головки в бактериальную клетку, а капсид бактериофага остается снаружи бактерии. Инъецированная внутрь клетки нуклеиновая кислота подавляет биосинтез компонентов клетки, заставляя ее синтезировать нуклеиновую кислоту и белки бактериофага. Образовавшиеся в разных частях клетки компоненты бактериофага собираются в фаговые частицы путем заполнения фаговой нуклеиновой кислотой пустотелых капсидов головки. Сформированная головка соединяется с хвостовой частью, образуя новый фаг. Затем в результате лизиса клетки бактериофаги выходят из нее.
Рис. 28. Взаимодействие бактериофага с оболочкой бактерии