Методы выделения, культивирования и идентификации микроорганизмов

В естественных условиях микроорганизмы существуют в смешанных популяциях, ассоциациях и пр. Для установления этиологического фактора инфекционного заболевания бактериологическим методом, требуется выделение микроба в чистом виде. Для этого применяют различные питательные среды из перечисленных выше групп (транспортные, обогащения, элективно-диагностические, дифферернциально-диагностические и пр.) в определенном порядке.

Вначале делают посев исследуемого материала (кровь, фекалии, моча, соскобы розеол, мокрота, носоглоточные смывы и пр.) после определенной его обработки как обычно на среды обогащения и элективно-диагностические (при необходимости перемещения посевов на большие расстояния применяют среды консервирования). Засеянные питательные среды выдерживают при температуре, оптимальной для данного микроба (обычно в термостате при 37⁰ С).

После экспозиции просматривают чашки Петри и выбирают подозрительные колонии (по цвету, форме, размеру, краям колонии и пр. - это диагностические признаки), которые пересевают на скошенный агар, с целью получения чистой культуры в достаточном для дальнейшей работы количестве. Со скошенного агара делают пересев на дифференциально- диагностические среды.

При исследовании на энтеробактерии вводят дополнительные элективные среды (Олькеницкого и пр.), откуда делают пересевы на дифференциально-диагностические среды, с целью определения свойств выделенной культуры: ферментативных, протеолитических, бродильных, токсигенных и других, что является основой в определении вида, подвида и др. качеств исследуемой культуры.

Такая схема выделения микроба и идентификации может длиться 3-4 дня или более в зависимости от вида микроба (свойств). Конечным результатом является выделение штамма и установление его вида, а возможно – серовара, фаговара, антибиотикочувствительности и пр., т.е. проводится не только постановка этиологического диагноза, но и даются некоторые рекомендации для лечения конкретных инфекционных больных.

Чистая культура - это потомство одной микробной клетки, выращенное на питательной среде, т.е. культура моноклона.

Штамм - это чистая культура определенного вида микроба, выделенная в данное время из конкретного материала.

Вид – это категория, обозначающая микроорганизмы, имеющие сходный генотип и несколько различающиеся по фенотипу.

Род - это собирательный термин, обозначающий сходные по генотипу и несколько различающиеся по фенотипу (свойствам) микроорганизмы нескольких видов.

Для культивирования микроорганизмов необходимы не только питательные среды, но и условия изоляции пассируемых микробов от загрязнения.

Это достигается стерильными условиями культивирования.

Посев инокулята

В бактериологической практике нет малозначащих этапов, которые можно исполнить небрежно. Для конечного результата является очень важным: как и в какие сроки был взят материал для исследования и где он был засеян (у постели больного или в лаборатории).

Если материал перевозят в лабораторию, то важно в какие сроки он будет доставлен, каким образом и когда будет сделан посев.

Для каждой инфекции существует инструктивно-методическая литература по режиму и срокам доставки, способам забора материала и пр.

Первым этапом бактериологических исследований является посев исследуемой пробы на элективно-диагностические и среды обогащения. Питательные среды следует выбирать в зависимости от предполагаемых возбудителей и от типа материала (кровь, фекалии и пр.).

Посев проводят петлей (материал наносят у края чашки, затем рассеивают по секторам), шпателем (материал наносят на поверхность агара, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его в поверхность среды), тампоном (тампон с материалом вносят в чашку, делают площадку и круговыми движениями чашки и тампона втирают материал в поверхность среды) и пр.

Для разных целей посевы, например, делают штрихами. Карандашом расписывают сектора на дне чашки и в каждом секторе посевы делают от края чашки к середине штрихами, которые не должны перекрещиваться (обычный посев). Иногда делают посев газоном:1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура) наносят пипеткой на агар и тщательно распределяют по всей поверхности, покачивая чашку. Надписи делают на чашках со стороны дна.

При пересеве из пробирки в чашку Петри, вначале берут пробирку с материалом в левую руку между указательным, большим и средним пальцами, положив ее на ребро кисти. Петлю берут в правую руку как "писчее перо", прокаливают и после остужают внутри пробирки. Пробку пробирки зажимают между мизинцем и ладонной поверхностью кисти правой руки и вынимают на огнем спиртовки, обжигая края пробирок. Вводят петлю внутрь пробирки, прикасаются к краю питательной среды для охлаждения петли, а затем набирают материал с поверхности среды, не повреждая агар.

Затем петлю с материалом вынимают из пробирки, быстро над огнем спиртовки закрывают пробирку пробкой и ставят ее в штатив, немного приподнимают крышку у чашки левой рукой, вводят внутрь чашки петлю, делают небольшую площадку, втирая материал, а затем, поворачивая чашку, засевают штрихами по секторам чашки. Петлю вынимают и быстро закрывают чашку, а петлю стерилизуют над огнем и ставят в штатив.

При посеве из пробирки в пробирку, обе держат в левой руке наклонно, как описано выше. Петлю держат как обычно, прокаливают, затем одновременно вынимают пробки из обеих пробирок, как описано выше. Петлю вводят в пробирку с посевом, набирают культуру и вынимают, вводят в другую пробирку и производят посев штрихами от нижнего края косяка к верхнему.

Если засевают в жидкую среду, то петлю держат некоторое время в этой среде, чтобы культура могла распределиться в жидкости.

При посеве в полужидкий агар делают петлей укол в эту среду. Затем петлю вынимают, закрывают пробками обе пробирки над огнем, стерилизуют петлю и ставят в штатив, а затем ставят и пробирки.

При посеве на скошенный агар, делают штрихи, начиная с нижнего края скошенного агара, с конденсационной воды (если она есть). При посеве на среды Ресселя, Олькеницкого и Клиглера после штрихов делают укол внутрь агара.

При посеве жидкого материала пользуются пипетками или петлей. При посеве пробы для количественного учета микроорганизмов наносят 1 мл материала пастеркой на чашку и шпателем втирают его в поверхность первой чашки, не прожигая шпатель, переносят его во вторую чашку и также втирают, затем и в третью. Лишнюю жидкость отсасывают из чашек пипетками.

Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С (обычно) или при температуре, оптимальной для культуры. Срок инкубации зависит от скорости деления клеток, например, бактерии кишечной группы обычно растут 18-24 ч, холерный вибрион на пептонной воде - 6 ч, другие микробы, например, лептоспиры - до 5-6 дней и т.д.

Изучение изолированных колоний

По истечение определенного срока на засеянных чашках микробы формируют колонии разной морфологии.

Колония - это видимое невооруженным глазом характерное скопление микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде как потомство от одной из засеянных микробных клеток.

Это второй этап бактериологического анализа. Морфология выросших колоний - это важный культурально-диагностический признак. Колонии микробов изучают в проходящем свете с помощью лупы или невооруженным глазом. Рассматривают чашку со стороны дна.

Оценивают морфологию по определенным критериям:

0* размер колонии (микроскопический, мелкий, средний, гигантский),

1* форма колоний (круглые, неправильные, отросчатые и пр.),

2* профиль колоний (плоский, выпуклый, куполообразный, блюдцеобразный и пр.),

3* характер поверхности (гладкая, шероховатая, морщинистая, изрезанная и пр.),

4* прозрачность колонии (прозрачная, мутная, полупрозрачная),

5* пигмент (желтый розовый красный, кремовый, перламутровый и пр.),

6* структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и пр.),

7* края колонии (ровные, фестончатые, изрезанные, волнистые, бахромчатые и пр.),

8* консистенция колонии (мягкая, сухая, слизистая, сметанообразная, крошковидная),

9* тип колонии (круглые, влажные, выпуклые – S-тип, сухие, шероховатые, края неправильные – R-тип, тягучие, слизистые, валик вокруг колонии – М-тип)

На этом этапе часть колонии берут петлей для приготовления мазка. При подтверждении однородности культуру засевают на скошенный агар для накопления и на некоторые среды.

Признаки роста бактерий на жидкой питательной среде:

Рост бактерий на жидкой питательной среде оценивают по нескольким признакам:

1. Наличие пленки (сверху среды, пристеночная и пр.),

2. Наличие осадка (плотный, рыхлый, волокнистый и пр.),

3. Наличие помутнения среды,

4. Комбинация этих признаков.

1. Равномерное помутнение жидкой питательной среды (Shigella и др.),

2. Придонный рост бактерий – осадок на дне. Осадок может быть скудный, обильный, по виду – крошковидный, гомогенный, волокнистый, в виде рыхлых хлопьев, компактный (Cl. botulinum), зернистый (Corynebacterium), войлокообразный (Mycetes), в виде комочков ваты (Bacillus). По консистенции – вязкий, слизистый, хрупкий, пастообразный. Питательная среда над ним может быть: прозрачной (Bacillus) или мутной (Escherichia). Цвет осадка среды определяется пигментами, продуцируемыми культурой. Придонный рост характерен для анаэробов.

3. Пристеночный рост бактерий. Среда прозрачна, а бактерии растут в виде пленки, хлопьев, зерен и пр., прикрепившись к внутренней поверхности стенок сосуда. Снимается с трудом или легко.

4. Поверхностный рост. Этот тип роста характеризуется наличием пленки или едва заметного налета.

а) пленка тонкая, нежная, бесцветная, едва заметная,

б) пленка влажная, толстая, хорошо видимая, вязкая, слизистая, прилипает к петле и тянется за ней,

в) пленка плотная, сухая, напоминает кусочек кожи, снимается целиком в виде диска по диаметру пробирки,

г) пленка плотная сухая, сморщенная бородавчатая, разбивается на кусочки, которые погружаются вглубь жидкости.

Рост бактерий в полужидком агаре

Подвижные микробы вызывают помутнение среды.

Они распределяются практически по всей толще среды.

Неподвижные бактерии растут по ходу укола петлей, образуя разные по форме и размерам помутнения среды – в основном конической или цилиндрической формы с вариациями.

Окружающая среда всегда остается прозрачной.

Пигменты микроорганизмов

Цвет колоний определяется пигментами, которые продуцируют микроорганизмы. Патогенные микробы, в основном, пигментов не образуют и в проходящем свете колонии остаются достаточно прозрачными.

Пигментообразующие виды микробов придают колониям разный цвет:фарфорово-белый, золотисто-оранжевый, красный, синий, сиреневый, черный, зеленый, коричневый и пр.

Известны пигменты двух типов:растворимые в воде и растворимые в органических соединениях. Растворимые в воде пигменты окрашивают среду (Pseudomonas aeruginosa). Наиболее распространены в природе такие пигменты как меланины, каротины, ксантофилы. Первые являются нерастворимыми в воде пигментами, синтезирующимися из фенольных соединений. Они защищают микробы от действия токсичных перекисных радикалов О₂. Многие пигменты бактерий обладают антимикробным действием.

Меланиновые пигменты черного и коричневого цвета, продуцируются бактеройдами.

Хинолоновые пигменты дают желтый цвет, продуцируются микобактериями, кокками.

Пирроловые пигменты дают ярко-красный цвет, продуцируют Serratio marcescens.

Изучение биохимических свойств культур

Биохимические свойства выделенной чистой культуры изучают на третьем этапе или последующем, в зависимости от результатов 2-го этапа. Культуру, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопирования мазка, окрашенного по Граму. При этом, изучают морфологию клеток бактерий, их расположение и тинкториальные свойства. При необходимости применяют другие специальные красители. Далее приступают к изучению биохимических и др. свойств чистой культуры, по возможности используя данные микроскопии.

Определение протеолитических свойств. Способность выделенной культуры расщеплять белки протеолитическими ферментами изучают на средах с молоком, желатиной, пептоном, сывороткой и пр.

В процессе ферментации микробами пептонов, образуются индол (C₈H₇N), сероводород (H₂S), аммиак (NH₃) и др. соединения. Для обнаружения сероводорода после посева под пробку помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом. При выделении сероводорода бумага чернеет, ввиду образования сернистого свинца (PbS).

Индол определяют с помощью индикаторной бумажки, которую пропитывают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты (C₂H₂O₄). При выделении индола бумажка краснеет. Возможно его определение с помощью реактива Эрлиха.

Аммиак обнаруживают при помощи увлажненной красной лакмусовой бумажки. При выделении аммиака бумажка синеет

Разжижение желатина учитывают при посеве уколом в столбик питательной среды. Те микроорганизмы, которые имеют соответствующий фермент, могут разлагать желатин, При этом, разжиженный желатин может приобретать разнообразные формы (воронки, елочки и пр.).

Просветление молока (пептонизация) осуществляют микробы, разлагающие казеин. Молоко просветляясь, приобретает вид молочной сыворотки.

Определение сахаролитических свойств микробов. Эти свойства определяют на средах Хиса и др. В их состав входит лактоза, глюкоза и др. углеводы. Микробы, сбраживающие

какой-либо углевод, определяют за счет изменения окраски среды в пробирке (это учет образования кислоты). Газообразование определяют по наличию растрескивания агара или пузырьков газа в толще полужидких сред и в поплавках в жидких средах.

Определение ферментов микробов. Метаболические процессы в клетках микробов протекают с участием ферментов. Определенные микроорганизмы имеют индивидуальный

набор ферментов. С помощью ферментов коагулируется плазма крови, может расщепляется соединительная ткань в организме и пр.

Приводим некоторые методы определения ферментов у бактерий, регистрируемые по конечному феномену, получаемому за счет расщепления субстрата.

Гемолизины - разрушают эритроциты, что проявляется просветлением зоны вокруг колонии бактерий на кровяном агаре.

Плазмокоагулаза - коагулирует плазму крови, что проявляется по способности некоторых бактерий свертывать плазму в мелкие хлопья.

Гиалуронидаза - расщепляет NN связи в соединительной ткани, что проявляется в опыте: в пробирку с культурой вносят гиалуроновую кислоту и после 30 мин экспозиции при 37⁰ С добавляют крепкой уксусной кислоты. При наличии фермента бактерий гиалуроновая кислота утрачивает способность образовывать сгусток.

У выделенных бактерий с установлением вида, определяют биовар, фаговар, серовар, хемовар и пр.

Культивирование анаэробных бактерий

Анаэробы - это микроорганизмы с определенным типом метаболизма, исключающим использование кислорода. Способы культивирования, выделения и идентификации таких микроорганизмов существенно отличаются от аэробных бактерий.

Питательные среды для культивирования анаэробов:

1. Анаэробный кровяной агар. Готовится на основе кровяного агара и среды 199 (10 % твин-80), 10 мкг гемина, 5 % цитратной крови и др. ингредиентов.

2. Желточный агар. В среду на основе эритрит-агара добавляют 10 мкг гемина, 0,2 % глюкозы, 20 % суспензию яичного желтка и др. ингредиенты. С помощью среды определяют лецитовителлазную и липазную активность анаэробов. Вокруг выросших колоний анаэробов образуется зона помутнения, а при наличии липазы - зона радужной блестящей видимой при косом освещении опалесценции.

3. Среда для контроля стерильности (СКС). Коммерческая среда. Используется для транспортировки засеянного материала и как среда обогащения.

4. Среда Китта-Тароцци. Готовят на основе бульона Хоттингера с добавлением кусков печени или мяса, разливается по пробиркам. Используют как среду накопления.

5. Среда Вильсона-Блера. Готовится на основе сахарного агара с добавлением 1 % натрия сернокислого и 0,08 % хлорного железа. Среду разливают по пробиркам высоким столбиком. Используется для ускоренной диагностики газовой гангрены.

6. Сахарный агар. Готовится на основе эритрит-агара с добавлением 1 % глюкозы.

Существуют и другие питательные среды для анаэробов.

Анаэробный тип метаболизма гораздо менее продуктивен во времени, чем у аэробов, поэтому культивирование анаэробов требует более богатых питательных сред в более высоких концентрациях.

Методы создания анаэробных условий

Культивирование анаэробов требует не только определенных питательных сред, но и условий их выращивания. Такие условия создаются разными способами:

Химические способы создания анаэробных условий:

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в среде.

2. Гидросульфат натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл 20 % свежеприготовленного раствора Na₂S₂O₄ и 16 мл 50 % КОН. Эта смесь работает лучше, чем пирогаллол.

3. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в среде (анаэростаты, эксикаторы, прозрачные газонепроницаемые пластиковые пакеты) и пр.

Биологические методы создания анаэробных условий:

1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну сторону чашки засевают исследуемый на анаэробы материал, а на другую - культуру аэроба, который способен энергично поглощать кислород. Чашку закрывают крышкой, а края нужно залить парафином. В качестве поглотителя часто используют Serratia marcescens.

2. Помещают в питательную среду кусочки печени или других органов, клетки которых активно поглощают кислород.

Для более тщательного создания бескислородных условий используются анаэростаты, заполняя их после отсасывания воздуха инертными газами.

Выделение чистой культуры анаэробов

Первичные посевы анаэробов делают в анаэробных условиях на среду обогащения (СКС или тиогликолевая среда, Китта-Тароцци), после определенной экспозиции делают высев на плотные питательные среды:сахарный кровяной агар, сахарный агар и др. При появлении роста делают пересев микробов на СКС или Китта-Тароцци для получения чистой культуры.

1. Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной среды, помещают в анаэробные условия при 37⁰ С на 24-72 ч. Колонии пересевают на среду для контроля стерильности или Китта-Тароцци для выделения чистой культуры.

2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл 0,85 % раствора хлорида натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50⁰ С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком После перемешивания этим же капилляром последовательно, без промежуточной стерилизации капилляра, засевают еще 2 пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Выросшие через 24-72 ч в глубине агара изолированные колонии засевают на СКС или Китта-Тароцци.

3. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром, для чего разливают его по высоким столбиком. В первую пробирку вносят 3-4 капли исследуемого материала, перемешивают запаянным капилляром и не стерилизуя переносят его в другие пробирки. Содержимое пробирок выливают в соответствующие чашки Петри, на дне которых лежит стеклянная пластинка 6х6 см. Среду заливают так, чтобы она попала между пластинкой и дном чашки. При появлении роста бактерий пластинку удаляют, а колонии пересевают на указанные выше среды.

4. Метод Вайона-Виньяла. Готовят разведения исследуемого материала как указано выше в пробирках с сахарным агаром. Пастеровской пипеткой насасывают из каждой пробирки материал, после чего концы пипеток запаивают. После получения роста бактерий пипетку разламывают и переносят в СКС или в Китта-Тароцци.

5. Разновидность метода Перетца. Материал засевают вместе с сахарным агаром на крышку чашки Петри и закрывают донышком чашки. Щель между их краями заливают парафином.

Методы культивирования грибов

Грибы - это аэробы или факультативные анаэробы. Для их культивирования используют специальные среды - Сабуро΄, сусло-агар, овощные среды (картофельные, морковные и пр.) и др.

Среда Сабуро′:

1. агар - 20,0 г

2. пептон - 10,0 г

3. мальтоза (глюкоза) - 40,0 г

4. вода дистиллированная - до 1000 мл.

5. стерилизация в автоклаве 10 мин при 120⁰ С, рН доводят до 5,6-6,0.

Выбор среды проводят, ориентируясь на предполагаемый вид изучаемых грибов, например, дерматофиты лучше растут на агаре Сабуро′, плесени - на среде Чапека-Докса., кандиды - на среде Городковой и др.

Для получения зрелых колоний грибов требуется выращивание их в течение двух-трех недель (кроме дрожжей). Макроморфологию колоний изучают невооруженным глазом и при малом увеличении микроскопа. Учитывают цвет, форму, консистенцию, края и пр. качества колонии. Далее готовят препарат для микроскопии, для чего часть мицелия берут петлей и осторожно переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют. Учитывают расположение мицелия, конидиеносцев, расположение спор и пр.