Рост и культивирование прокариот

ЛЕКЦИЯ

РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОКАРИОТ

План лекции:

1.Основные параметры роста культур прокариот.

2.Методы получения культур прокариот.

Культивирования анаэробных микроорганизмов

Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности твердой или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Аэротолерантные бактерии хорошо растут на поверхности агара и чашках при низком уровне кислорода. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному (редокс, Eh) потенциалу среды. При увеличении Eh выше – 100 мВ (милливольт), обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для удаления кислорода и создания соответствующих условий среды можно восполь-зоваться следующими методами.

1. Культивирование в микроанаэростате – аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с
5 % СО₂ и 10 % Н₂.

2. Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода используют дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и другие реактивы.

3. Использование восстанавливающих агентов, таких как цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды.

4. Выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. В жидкой среде с восстанавливающими агентами перед внесением анаэроба в среду проводят культивирование, например, E.coli, что приводит к удалению из среды остаточного кислорода. Далее клетки E.coli убивают нагреванием и высевают анаэробные микроорганизмы. Существует и другая модификация метода. На половине чашки Петри засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом.

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки.

Выделение чистой культуры предполагает проведение трех этапов: 1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры; 3) определение чистоты выделенной культуры.

Выделение чистой культуры

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов. Кроме того, существует метод Последовательного разведения в твердой среде.Это самый простой способ посева по чашкамПетри, а также метод упорядоченного посева(На лабораторных занятиях).

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

а) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

б) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

в) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

г) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдается сплошной рост бактерий, в последующих чашках формируются изолированные колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рис. 1, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рис. 1, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рис. 1), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рис. 1).

Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

Пуассонер.

Пуассонер представляет собой микробиологический инокулятор, конструкция которого обеспечивает распределение Пуассона для числа колоний на чашках Петри. Он изготовлен из нержавеющего металла и похож на штамп (или щетку) с цилиндрическими штырями (зубцами). Штыри могут быть сделаны из заклепок (диаметром ~2,0 мм и длиной 1,5‑2,0 см) с тщательно выровненными торцами. Они крепятся на металлической основе на равных расстояниях друг от друга таким образом, чтобы целиком заполнить внутреннюю часть чашки Петри. Рекомендуемое оптимальное количество штырей 163 или 187 с расстоянием между ними 3,0 мм (рис.).

Рис. Пуассонер: общий вид (a) и одно из его рабочих положений – лицом вниз (b)

Рис. Расположение колоний, порожденное пуассонером (красные чашки) и традиционным методом посева с помощью пипетки и шпателя (зеленые чашки).

Последовательные разведения в твердой среде– самый простой способ посева по чашкам, который заключается в том, что после переноса пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15 – 20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара.

ЛЕКЦИЯ

ЛЕКЦИЯ

Принципы систематики.

Систематика (таксономия) бактерий является не только одним из наиболее важных и сложных, но и наименее разработанным разделом микробиологии.

Задачами систематики являются классификация, номенклатура и идентификация микроорганизмов.

Классификация – распределение множества микроорганизмов по группам.

Номенклатура – присвоение названия отдельным группам и микроорганизмам.

Основной таксономической категорией является вид.

Вид – это группа близких между собой организмов, имеющих общее происхождение и на данном этапе эволюции характеризующихся определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, обособленных отбором от других видов и приспособленных к определенной среде обитания.

Виды → в роды → в семейства → в порядки → классы → в отделы → царства.

Большое значение в микробиологии имеют такие понятия как штамм и клон. Штамм — более узкое понятие, чем вид. Штамм - это культуры бактерий одного и того же вида, выделенные из различных источников или даже из одного источника, но в разное время. Штаммы различаются отдельными специфическими признаками, например, вирулентностью, устойчивостью к антибиотикам, ферментативной активностью.

Клон – популяция (культура) бактерий, полученная из одной бактериальной клетки.

Идентификация – устанавливает принадлежность микроорганизмов к определенному таксону на основании наличия определенных признаков. В большинстве случаев идентификация заключается в определении видовой и родовой принадлежности микроорганизмов.

Определение бактерий до вида важно с позиции не только познавательной, общебиологической, но и связано с решением прикладных и научных задач. Особенно это важно для медицинской, ветеринарной и промышленной микробиологии.

В настоящее время в микробиологии приняты 2 основных подхода в систематике, обусловленных существованием двух систем классификации: филогенетической (естественной) и фенотипической (искусственной).

В основу филогенетической классификации положена идея создания системы прокариот, объективно отражающей родственные отношения между разными группами бактерий и историю их эволюционного развития. Фенотипическая классификация преследует, в первую очередь, практические цели, заключающиеся в том, чтобы установить принадлежность микроорганизма к определенному таксону.

При классификации бактерий учитывается большое количество различных свойств и признаков (критериев систематики). Чем больше сходных признаков имеют сравниваемые микроорганизмы, тем больше оснований для включения их в одну группу.

При идентификации бактерий возможно использование генетических, фенотипических и серологических подходов и критериев систематики.

Генетические критерии систематики.

Наиболее объективными и дающими представление о филогенетических связях между организмами являются ГЕНЕТИЧЕСКИЕ (МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ) КРИТЕРИИ. К ним относятся:

1. Определение относительного содержания ГЦ-пар в ДНК,

2. гибридизация нуклеиновых кислот,

3. методы генетического анализа (изучение переноса генов, генетических скрещиваний, картирование хромосом бактерий и др.),

4. рестрикционный анализ ДНК,

5. применение генетических зондов (ДНК зондов) (короткий отрезок ДНК или РНК известной структуры или функции, меченный каким-либо радиоактивным или флуоресцентным соединением),

6. определение нуклеотидных последовательностей в ДНК или РНК.

Относительное содержание ГЦ–пар в ДНКпредставляет собой стабильный признак, не зависящий ни от возраста, ни от условий культивирования, ни от отдельных перестроек генов в хромосоме. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным содержанием ГЦ-пар, и эту величину можно рассматривать как один из важных признаков вида.

Нуклеотидный состав ДНК бактерий можно определить химическими и физическими методами. К химическим относится метод хроматографии на бумаге. Определение состава ДНК этим методом со­стоит из следующих основных этапов: выделение ДНК, ее гидролиз до азотистых оснований, разделения их с помощью хроматографии на бумаге, элюирование оснований с бумаги (извлечение вещества вымыванием его подходящим растворителем) и последующая ультрафио­летовая спектрофотометрия. Хотя этот метод довольно длителен и трудоемок, он позволяет определить непосредственное соотношение азотистых оснований в ДНК. Метод хроматографии на бумаге является классическим методом определе­ния нуклеотидного состава ДНК.

К физическим относятся методы определения содержания азотистых оснований по температуре плавления ДНК (температура при которой происходит денатурация ДНК, чем больше ГЦ-пар, тем выше ее температура плавления), метод ультрацентрифугирования ДНК в градиенте плотности хлористого цезия. Метод основан на том, что имеется линейная зависимость между плотностью ДНК и содержанием в ней ГЦ-пар оснований.

Более тонким методом оценки генетического сходства является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот,с помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов. Этот метод позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о степени родства между организмами.

Метод генетического анализа. Перенос генетической информации и рекомбинация ее с ДНК реципиента может происходить только между двумя родственными микроорганизмами. Осуществлению межвидового, межродового переноса генов могут препятствовать внешние барьеры: например, различия в строении пограничных слоев клеток, что мешает их конъюгации или необходимому для трансдукции прикреплению бактериофага. Включение каждого отдельного фрагмента молекулы ДНК донора зависит от степени его гомологии с ДНК реципиента именно в том небольшом специфическом участке хромосомы, в котором должна произойти рекомбинация.

Рестрикционное картирование. Ферменты рестриктазы способны распознать специфические нуклеотидные последовательности и только в строго определенных участках (сайтах рестрикции) «разрезать» молекулы ДНК на фрагменты (рестрикты). Этот метод дает возможность выявить сравнительно тонкие различия в последовательности нуклеотидов ДНК и может использоваться для дифференциации микроорганизмов на внутривидовом уровне.

Метод молекулярных, или генных зондов (ДНК-зондов)основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический и наиболее консервативный для данного вида бактерий ген, с полимерной ДНК изучаемого микроорганизма. С помощью этого метода можно идентифицировать любой биологический объект. Точность метода зависит от используемого зонда (его «чистоты»). Разрешающая способность метода может быть повышена с помощью цепной ДНК-полимеразной реакции. В основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) лежит многократное реплицирование специфического участка нуклеотидной последовательности, катализируемое ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, и использование праймера – фрагмента ДНК, несущего наиболее специфичную для данного микроорганизма нуклеотидную последовательность гена. С помощью праймераобнаруживают искомый фрагмент идентифици­рующего микроорганизма. ПЦР может быть использована для идентификации ДНК любого микроорганизма, если для него имеется соответствующий праймер.

Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) дает возможность проводить сопоставительный анализ последовательностей в различных молекулах ДНК и РНК. Чаще всего анализируются нуклеотидные последовательности рибосомных РНК - 16SpPHK. Чем больше различий в последовательности нуклеотидов 16SрРНК у двух бактерий, тем раньше началось расхождение между ними, тем дальше они отстоят друг от друга в генетическом родстве. На основании исследований профессора Иллинойского уни­верситета К.Веза (C.Woese) сделана попытка перехода к филоге­нетической классификации микроорганизмов. При этом сравни­вают нуклеотидные последовательности I6S рРНК, состоящей из 1 500 нуклеотидов, из которых 900 — консервативны. На основе множества сравнений с помошью компьютера было построено филогенетическое древо (рис. I). Анализ I6S рРНК позво­ляет определить место микроорганизма на филогенетическом дре­ве, а нахождение видового названия ведется традиционными мик­робиологическими методами. При этом 90% совпадений указыва­ет на принадлежность к определенному роду, 97 % — к определен­ному виду.

В настоящее время разрабатывается классификация всех живых существ, в которой выделены три домена (надцарства): Bacteria, Archaea и Eukarya на основании анализа нуклеотидной последова­тельности 16S рРНК.

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СИСТЕМАТИКИ: морфологические, культуральные, физиологические и биохимические.

Морфологические признаки – форма тела, размеры клеток и их взаимное расположение, тип жгутикования, наличие капсулы, подвижность, окраска по методу Грамма, способность образовывать споры, способность к образованию покоящихся клеток.

Культуральные признаки – проявляются при выращивании бактерий в различных условиях: особенности роста бактерий на плотной питательной среде (размер, окраска, форма колоний) и в жидких питательных средах (образование осадка, пленки, помутнения и т.д.).

Физиологические признаки – типы питания, отношение к температуре, способы получения энергии, потребность в факторах роста, характер вторичных метаболитов, отношение к кислороду, к условиям рН среды и др.

Биохимические признаки – выражаются в наличии тех или иных ферментов, образовании определенных продуктов метаболизма (кислоты, спирты, газы), типе запасных веществ, химическом составе клеток.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СИСТЕМАТИКИ– основаны на специфических реакциях антигенов (компонентов клеточных стенок, жгутиков, капсул, ДНК и токсинов) идентифицируемых микроорганизмов с антителами, содержащимися в сыворотках. Между антигенами и соответствующими антителами происходит связывание, что положено в основу методов серологической диагностики. Серологические методы являются важным инструментом в диагностике и лечении инфекционных заболеваний человека и животных поскольку с их помощью можно не только идентифицировать возбудителя заболевания, но и обнаружить в крови больных и переболевших специфические антитела к соответствующим возбудителям.

Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариотных организмов решается с помощью Определителя бактерий Берги, выпускаемого периодически Обществом американских бактериологов с привлечением крупных специалистов в области изучения тех или иных групп бактерий. Первое издание вышло в 1923 г., а последнее девятое – вышло в 4-х томах в 1984-1989 гг.

В девятом издании Определителя бактерий Берги все обнаруженные организмы, отнесенные в царство Prokaryotae, разделены на 33 группы. Основ­аная идея классификации «по Берги» — легкость идентифика­ции бактерий по совокупности фенотипических, генотипических признаков. Ценность определителя в том, что он представляет собой наиболее полную сводку известных бактериальных форм и самое современное пособие для идентификации бактерий.

В этом издании бактерии на основании строения пограничного слоя клетки разделены на четыре основных категории (отдела):

1) Gracilicutes (от лат. gracilis – тонкий, cutes – кожа) – грамотрицательные эубактерии, имеющие клеточные стенки;

2) Firmicutes – (от лат. firmus – прочный) – грамположительные эубактерии, имеющие клеточные стенки;

3) Tenericutes (от лат. tener – мягкий, нежный) – эубактерии, лишенные клеточных стенок;

4) Mendosicutes (от лат. mendosus – ошибочный)– архебактерии, клеточные стенки которых отличаются от аналогичных структур прокариот).

Группы 22-29. Актиномицеты.

Группа 31. Метаногены.

ЛЕКЦИЯ

РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОКАРИОТ

План лекции:

1.Основные параметры роста культур прокариот.

2.Методы получения культур прокариот.