Лабораторно - практическое занятие № 13.

Тема: Масляно – кислое брожение. Спиртовое брожение.

Цель работы:Ознакомить студентов с процессами спиртового и масляннокислого брожения. Микроскопирование дрожжей и маслянокислых бактерий.

Спиртовое брожение — это процесс превращения углеводов, вызываемый дрожжами, некоторыми видами бактерий (Zymomonas mobilis, Sacina ventriculi и др.) и отдельными представителями мукоровых грибов. Однако практическое значение имеет лишь спиртовое брожение, осу­ществляемое дрожжами.

Дрожжи встречаются на поверхности растений, плодов, ягод, зерна, в воздухе, почве. Это одноклеточные, неподвиж­ные организмы диаметром 8—15 мкм (для сравнения: диаметр бактериальной клетки 0,5—0,7 мкм). Клетки дрожжей округ­лой, овальной или несколько удлиненной формы, содержат хо­рошо заметное под микроскопом ядро. В них встречаются раз­личные включения: капли жира и волютина, сильно прелом­ляющие свет; гликоген.

Дрожжи обычно размножаются бесполым путем: почкованием (Saccharomyces и др.), реже — делением (Schizosaccharomyces), но способны и к спорообразованию. Споры могут фор­мироваться как без предварительного слияния двух клеток, так и после полового процесса, т. е. в результате слияния содержи­мого двух клеток. В первом случае сумки со спорами возникают непосредственно из вегетативных клеток, во втором — из образовавшейся зиготы развивается сумка, в которой форми­руется от 4 до 12 спор (число спор обычно кратно 4). Однако образование спор у дрожжей наблюдается редко. Их появле­нию способствует резкий переход культуры с богатого питательного субстрата на бедный и хорошая аэрация.

Дрожжи сбраживают углеводы (моно- и дисахариды) с образованием этилового спирта по схеме:

С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СН₂ОН + 2СО₂

Источником азота служат пептоны, аминокислоты и ам­монийные соли. Дрожжи дезаминируют аминокислоты, по­требляя освобождающийся при этом азот. Образующиеся в процессе реакции высокомолекулярные спирты составляют главную часть сивушных масел. Дрожжи лучше развиваются при рН 4—6, устойчивы к высоким концентрациям сахара (до 70%) и спирта (до 14%).

Спиртовое брожение лежит в основе виноделия, пивова­рения. В хлебопекарной промышленности дрожжи выполняют роль биологических разрыхлителей теста: при брожении и ды­хании образуется диоксид углерода СО₂, благодаря чему увели­чиваются объем теста при выпечке и пористость хлеба. Боль­шинство видов культурных дрожжей, используемых в бродиль­ных производствах, принадлежит к роду Saccharomyces.

В пивоварении главное внимание обращают на полноту сбраживания мальтозы. В виноделии ценными оказываются побочные продукты, создающие «букет» вина.

Микроскопирование дрожжей. Познакомиться с морфологией дрожжей можно при исследовании препарата, приготовленного из бродящей жидкости. Для этого ее каплю стеклянной палочкой наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и после нанесения капли кедрового масла микроскопируют с иммерсионной системой объектива. При микроскопировании препарата в раздавленной капле конденсор следует немного опустить. На препарате надо найти клетки в стадии почкования и зарисовать их — это Saccharomyces cerevisiae.

Маслянокислое брожение.Возбудители маслянокислого броже­ния — строгие анаэробы, подвижные палочки с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования.

По преобладанию тех или иных конечных продуктов маслянокислое брожение подразделяют на истинно масляно­кислоеброжение (брожение глюкозы, крахмала), ацетонобутиловоеброжение, брожение пектиновых веществ.

Маслянокислые бактерии широко распространены в почве (как правило, содержатся в 90% почвенных образцов), навозе, загрязненных водоемах, в разлагающихся растительных остатках, молоке, на поверхности растений и т.д.

Процесс маслянокислого брожения протекает по схеме:

4С₆Н₁₂О₆ = 3CH₃CH₂CH₂COOH + 2СН₃СООН + 8СО₂ + 8Н₂

Глюкоза Масляная Уксусная Диоксид Водород

кислота кислота углерода

Кроме масляной, в процессе брожения в заметных коли­чествах образуется уксусная кислота, а при подкислении среды (до рН 5,5) — значительные количества бутилового спирта и ацетона.

Энергетическим материалом для маслянокислых бакте­рий служит крахмал, водорастворимые углеводы (декстрины, ди-, моносахариды), органические кислоты (молочная, пировиноградная) и спирты (маннит, глицерин). В качестве источника азота бактерии используют самые различные азотистые соединения: пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые — даже атмосферный азот.

Характерная особенность маслянокислых бактерий - способность накапливать в клетках гранулезу перед образованием спор.

Маслянокислое брожение крахмала исследуют на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими ¹/₃ высокой пробирки, до­бавляют немного мела, заливают водопроводной водой на ²/₃ и помещают на водяную баню при 80 °С на 10 мин для пасте­ризации. В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бак­терий, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры.

Элективные условия создают:

- наличием крахмала — источника углерода, используе­мого только микроорганизмами, содержащими фермент ами­лазу;

- пастеризацией;

- анаэробиозом (высокий столбик жидкости в пробирке и выделение в процессе брожения СО₂ и Н₂, вытесняющих воздух).

Через 2—3 дня картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. По окончании брожения культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых бактерий и качественного определения про­дуктов брожения.

Контрольные вопросы:

1. Виды дрожжей, участвующие в спиртовом брожении?

2. Что такое верховое и низовое спиртовое брожение?

3. В каких условиях осуществляется процесс спиртового брожения?

4. Техника микроскопирования дрожжей.

5. Бактерии осуществляющие маслянокислое брожение?

6. Перечислите виды маслянокислого брожения.

7. Необходимые условия для осуществления маслянокислого брожения.

8. Каким образом можно выделить бактерии, участвующие в маслянокислом брожении?