Культуральные свойства возбудителя дифтерии

Наиболее характерные колонии на среде Клауберга II с добавлением теллурита калия или натрия (элективная среда для выращивания С. diphtheriae). Они вырастают в виде почти черных колоний, выделяющихся на красном фоне среды. Цвет колоний обусловлен способностью С. diphtheriae в процессе роста восстанавливать теллуристый калий до элементарного теллура.

Микробы дифтерии не являются однородными по своим культурально - биохимическим свойствам и подразделяются на биовары gravis, mitis и intermedius. На среде Клауберга II через 48 часов бактерии биовара gravis вырастают в виде круглых (d 1,5- 2 мм) колоний с неровными краями, часто имеют приподнятый центр и радиальную исчерченность. Колонии серовато-черного цвета, напоминают маргаритки. Вариант mitis дает круглые выпуклые колонии черного цвета (d 1- 1,5 мм) с ровными краями. Вариант intermedius занимает промежуточное положение. Дает черные выпуклые с блестящей поверхностью колонии.

К работе № 3

Дифференциация коринебактерий

С. Diphtheria дифференцируют от дифтероидов по морфологическим свойствам, ферментации углеводов, способности продуцировать цистиназу и уреазу, токсигенности и антигенным признакам.

Способность бактерий продуцировать токсин устанавливают в реакции преципитации в агаре. Для этого в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15-20% лошадиной сыворотки, 0,3% мальтозы и 0,03% цистина, помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Исследуемые культуры подсевают в виде перпендикулярных к бумажке штрихов на расстоянии 0,6-0,8 см. Посевы инкубируют при 37⁰С 24 часа. Если культуры токсигенны, то в месте соединения токсина с антитоксином в агаре образуется преципитат в виде белых линий.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик агара с цистином и ацетатом свинца уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37⁰С 24 часа. Истинные дифтерийные палочки вызывают почернение по ходу укола, вокруг которого появляется зона коричневого цвета. В результате расщепления цистина ферментом цистиназой выделяется свободная сера, которая вступает в реакцию с ацетатом свинца, образуя сульфид свинца черного цвета.

Для определения уреазы (проба Закса) используют среду с мочевиной и индикатором – феноловым красным. Исследуемую культуру петлей растирают по стенке пробирки со средой, инкубируют 20-30 мин при 37⁰С. Истинные дифтерийные палочки не имеют фермента уреазы, поэтому цвет среды не изменится. Другие коринебактерии выделяют уреазу, которая расщепляет мочевину, рН среды меняется, и среда приобретает красный цвет.

Проводится реакция агглютинации с агглютинирующей дифтерийной сывороткой.

К работе № 4

Серодиагностика дифтерии

Антитела к С. diphtheriae определяют в крови больных, начиная с первых дней болезни и повторно через 10-14 дней. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках. Диагностическое значение имеют результаты серологических исследований при нарастании титра антител не менее чем в 3-4 раза.

Для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке человека применяют несколько реакций:

РПГА

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином) и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сы­воротке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты.В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

В нашей странеРПГА рекомендована в качестве основного метода для определения напряженности антитоксического иммунитета к С. diphtheriae, а также для оценки вакцинального иммунитета.

Оценка состоянияколлективного иммунитета требует более детальной характеристики, чем только установление процента серонегативных людей. Для этого следует давать развернутыепо каждому титру данные в РНГА т.е. с учетом степени напряженности. Отсутствие антител является безусловным показателем незащищенности; титры 1:10 и 1:20 можно считать индикатором пограничного иммунитета, не обеспечивающего безусловной защиты; однако заболевание при этом, как правило, протекает в легкой форме без летального исхода. Титры 1:80 и выше являются показателем защищенности группы.

Таким образом, процентное распределение показателей титров в каждом разведении дает качественную характеристику состояния иммунитета к дифтерии в обследованной группе. Например, выявление у 50% обследованных показателей пограничного иммунитета (титры 1:10, 1:20) свидетельствует о слабой защищенности группы, в которой с годами будет увеличиваться число лиц, не защищенных от дифтерии.

В настоящее время приняты следующие количественные критерии, характеризующие степень восприимчивости к дифтерии в зависимости от уровней антитоксических антител.

Содержание антитокси­ческих антител	Интерпретация результатов
< 0,01МЕ/мл	обследуемый восприимчивк дифтерии
0,01 МЕ/мл	минимальный уровень циркулирующих антител, обеспечивающий некоторуюстепень защиты
0,01-0,09 МЕ/мл	уровни циркулирующих антитоксических анти­тел, обеспечивающие некоторуюстепень защиты
0,1 МЕ/мл	защитный уровень циркулирующих антител
> 1,0 МЕ/мл	уровень антитоксина, обеспечивающий стойкуюдлительную невосприимчивость к дифтерии

ИФА

ИФА предназначен дляколичественного определения антибактериальных и антитоксических иммуноглобулинов М, G человека в сыворотке крови больных дифтерией, бактерионосителей издоровых людей. Принцип ИФА основан на образовании специфического комплекса антиген-антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена. При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по появлениюокрашенного продукта. Интенсивность реакции учитывается с помощью иммуноферментного анализатора или визуально.

3.Определение титра антител к дифтерийному токсину в сыворотке крови человека в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток.

Метод основан на том, что метаболическая активность и рост клеток культуры ингибируется дифтерийным токсином, который, в свою очередь, может быть нейтрализован антитоксином, содержащимся в сыворотке крови. Последовательное разведение сыворотки крови человека добавляют в лунки микропланшета, в которые затем вносят дифтерийный токсин в рабочей дозе и культуру клеток. Обнаружение по окончании инкубации (t 37^оС 5-6 суток) живых клеток культуры в лунках, содержащих определенные разведения сывороток, будет указывать на соответствующий титр антител к дифтерийному токсину в тестируемых сыворотках + проба на токсигенность.

К работе № 5