Лабораторная диагностика дифтерии

Ферментация

Уреазная актив-ность

Цистиназ-ная активность

Токсиген ность

Дифтерийная палочка а) gravis б) mitis

Дифтероиды: а) ложнодифтерий- ная палочка б) палочка ксерозы

Занятие № 2.2.2

Дифтерия и туберкулез. Лабораторная диагностика

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

изучить биологические свойства коринебактерий и патогенных микобактерий , принципы лабораторной диагностики дифтерии и туберкулеза. Классифицировать препараты для идентификации, лечения и профилактики дифтерии и туберкулеза

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Характеристику биологических свойств возбудителей дифтерии.

2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при дифтерии.

3. Основные клинические проявления дифтерии

4. Характеристику биологических свойств возбудителей туберкулеза.

5. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при туберкулезе

6. Основные клинические проявления туберкулеза.

7. Принципы лабораторной диагностики.

8. Препараты для идентификации, лечения и профилактики заболеваний.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

· дифференцировать возбудителей дифтерии и туберкулеза по морфологическим, тинкториальным,биохимическим и токсигенным свойствам;

· интерпретировать результаты серологических реакций;

· классифицировать препараты в соответствии с их назначением.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ: алгоритмом лабораторной диагностики инфекционных болезней;

методами анализа и оценки результатов лабораторной диагностики по выявлению возбудителей дифтерии и туберкулеза.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИИ

БАКТЕРИОСКОПИЯ

Работа № 1. Морфологические и тинкториальные свойства коринебактерий.

Цель: изучить морфологические и тинкториальные свойства коринебактерий.

Самостоятельная работа: микроскопировать готовые препараты - мазки. Зарисовать. Сделать вывод.

Corynebacterium diphtheriaе (простой способ окраски по Леффлеру)

Результат:_________________________________________________

__________________________________________________________

Corynebacterium diphtheriaе(сложный способ окраски - по Нейссеру)

Результат:__________________________________________________

___________________________________________________________

Дифтероиды

Результат:__________________________________________________

___________________________________________________________

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

БАКТЕРИОЛОГИЯ

Работа № 2. Культуральные свойства возбудителей дифтерии

Цель:изучитькультуральные свойства возбудителей дифтерии

Самостоятельная работа: описатьхарактер роста возбудителей дифтерии на плотной питательной среде. Сделать вывод.

Среда Клауберга (элективная среда)

Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________

Работа № 3. Дифференциация коринебактерий.

Цель: научиться дифференцировать дифтерийную палочку от дифтероидов.

Самостоятельная работа: на основании биохимических свойств и пробы на токсигенность, как основного признака возбудителя дифтерии дифференцировать дифтерийную палочку от дифтероидов. Сделать вывод.

Проба Пизу (на цистиназу)

«к» «

«о» «к» «о» «к» «о» «к»

дифтерийная палочка ложнодифтерийная

палочка ксерозы палочка

Результат:_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Проба Закса (на уреазу)

«о» «к» «о» «к» «о» «к»

дифтерийная палочка ложнодифтерийная

палочка ксерозы палочка

Результат:_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ферментация углеводов

глю сах крах глю сах крах

дифтерийная палочка gravis дифтерийная палочка mitis

глю сах крах глю сах крах

палочка ксерозы ложнодифтерийная палочка

Результат:_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Проба на токсигенность

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Дифференциация дифтерийной палочки от дифтероидов

СЕРОДИАГНОСТИКА

Работа № 4. Серологические исследования

Цель:оценить напряженность коллективного антитоксического иммунитетас помощью основного метода диагностики – РПГА.

Самостоятельная работа:Учесть готовый результат РПГА, поставленной с сывороткой больного и эритроцитарным дифтерийным антигенным диагностикумом для определения уровня антитоксического иммунитета. Записать вывод.

Направление:___________________________________________________________________

Ингредиенты:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Механизм:

Постановка:

1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 КС КД

Результат:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 5. Принципиальная схема лабораторной диагностики дифтерии

Самостоятельная работа:разобрать особенности лабораторной диагностикидифтерии. Отметить наиболее информативные методы лабораторной диагностики.

лабораторная диагностика дифтерии - student2.ru Исследуемый материал:

1) ______

2) ______

3) ______

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

БАКТЕРИОСКОПИЯ

А) Mycobacterium tuberculosis в мазке из мокроты.

Окраска по Цилю-Нильсену.

Результат:_________________________________________________

__________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Б) микроколонии (корд-фактор) M.tuberculosis: ускоренный метод диагностики (метод Прайса).Окраска по Цилю-Нильсену.

Результат:_______________________________________________

__________________________________________________________

БАКТЕРИОЛОГИЯ

СЕРОДИАГНОСТИКА

Токсин Шика

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

1. Вакцина БЦЖ

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6.____________________________________________________________________________

Туберкулин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

Стрептомицин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

Канамицин

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

Фтивазид

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

II. Заполнить контрольные карты по предложенным нозоформам:

ДИФТЕРИЯ

Таксономия возбудителя:

Семейство__________________________________________________________________

Род________________________________________________________________________

Вид________________________________________________________________________

Морфологические и тинкториальные свойства__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Культуральные и биохимические свойства____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Резистентность_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Эпидемиология

Источник инфекции_____________________________________________________________________

Механизм передачи______________________________________________________________________

Пути передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Факторы передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Патогенез и клиника

Входные ворота________________________________________________________________________

Инкубационный период_______________________________________________________________________

Основные факторы патогенности ________________________________________________

Основные фазы патогенеза_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Клинические симптомы_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Иммунитет___________________________________________________________________

Основные направления лабораторной диагностики_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Специфическая профилактика (препараты)____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лечение (препараты)_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

ТУБЕРКУЛЕЗ

Таксономия возбудителя:

Семейство__________________________________________________________________

Род________________________________________________________________________

Вид________________________________________________________________________

Антигенная структура______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Эпидемиология

Источник инфекции_____________________________________________________________________

Механизм передачи______________________________________________________________________

Пути передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Факторы передачи___________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Патогенез и клиника

Входные ворота________________________________________________________________________

Инкубационный период_______________________________________________________________________

Основные факторы патогенности ________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Иммунитет___________________________________________________________________

Лечение (препараты)_______________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя ___________________________________

Ситуационные задачи

1. В инфекционную больницу поступила девочка 2-х лет с высокой температурой, жалобами на боли в горле. На слизистой зева с трудом снимающиеся серовато-белые налеты. Лечащий врач поставил диагноз «дифтерия зева», ввел немедленно 5000 МE противодифтерийной сыворотки и отправил в лабораторию материал для исследования.

Оцените результат бактериологического исследования.

Вопросы1. Какой материал взят на исследования? 2. Какие исследования назначить?

3. Подтвердился ли клинический диагноз «дифтерия»? Почему? 4. Правильна ли была тактика лечащего врача? Почему?

2. Всем детям начальной школы была своевременно проведена ревакцинация дифтерийным анатоксином. Спустя 2 месяца одна ученица заболела дифтерией. Для оценки уровня антитоксического иммунитета в коллективе была поставлена РПГА. Оценить результаты РПГА при обследовании школьников. Оформить протокол исследования. Сделать вывод.

(Для учета результатов исследования выделяется планшет с реакцией РПГА.)

Вопросы1. У кого из обследованных школьников напряженный антитоксический иммунитет к дифтерии? Почему? 2. Кому из обследованных необходимо ввести специфический препарат? Какой? Почему? 3. Как объяснить причину заболевания дифтерией одной ученицы?

Обследуе-мые школьники	Метод диагностики	Исследуемый материал	Диагностический препарат для РПГА	Разведения сыворотки	Единица измерения активности анатоксина
1/100	1/200	1/400	К
А. Б. Е.	Серологический	Сыворотка крови	Дифтерийный эритроци-тарный диагностикум	+ + -	+ - -	+ - -	- - -	ИЕ - иммуногенная единица
				«+» - склеенные эритроциты в виде «зонтика» «-» - отсутствие гемагглюти-нации - «пуговка»

3. В туберкулезном диспансере при лабораторном обследовании семьи, состоящей из девочки 7 лет и трех взрослых людей (матери, отца и дяди ребенка), установлено следующее:- у девочки положительная реакция Манту, Микроскопия мокроты, посев ее и биологическая проба дали отрицательные результаты.

- у матери обнаружены туберкулезные палочки только в посеве мокроты.

- у отца туберкулезная палочка обнаружена при микроскопии мокроты.

- у брата матери - положительная реакция Манту, результаты всех остальных исследований отрицательные.

Обследуемые	Реакция Манту	Микроскопия мокроты	Посев мокроты	Биологическая проба
Ребенок	+	-	-	-
Отец	-	+	Не проводился	-
Мать	-	-	+	Не проводилась
Брат матери	+	-	-	-

Вопросы: 1. У кого из них лабораторно подтверждается диагноз «туберкулез»? 2. Кто из них должен быть оставлен под наблюдением врача диспансера?

4. Ребенок 2 лет с положительной реакцией Манту заболел корью. Через 2 недели после выздоровления у него появились субфебрильная температура, общее недомогание. Повторная реакция Манту оказалась отрицательной. Что заподозрил врач? Почему повторно была поставлена реакция Манту? Как объяснить исчезновение аллергической реакции к туберкулину?

5. В инфекционную больницу поступила девочка 2-х лет с высокой температурой, жалобами на боли в горле. На слизистой зева с трудом снимающиеся серовато-белые налеты. Лечащий врач поставил диагноз дифтерия зева, ввел немедленно 5000 МE противодифтерийной сыворотки и отправил в лабораторию материал для исследования.

Оцените результат бактериологического исследования.

Вопросы1. Какой материал взят на исследования? 2. Какие исследования назначить?

3. Подтвердился ли клинический диагноз дифтерии? Почему? 4. Правильна ли была тактика лечащего врача? Почему?

Пример решения задачи

Всем детям начальной школы была своевременно проведена ревакцинация дифтерийным анатоксином. Спустя 2 месяца одна ученица заболела дифтерией. Для оценки уровня антитоксического иммунитета в коллективе была поставлена РПГА. Оценить результаты РПГА при обследовании школьников. Оформить протокол исследования. Сделать вывод.

Для учета результатов исследования выделяется планшет с реакцией РПГА.

Обследуемые школьники	Метод диагностики	Исследуемый материал	Диагностический препарат для РПГА	Разведения сыворотки	Единица измерения активности анатоксина
1/100	1/200	1/400	К
А. Б. Е.	Серологический	Сыворотка крови	Дифтерийный анатоксинный эритроци-тарный диагностикум	+ + -	+ - -	+ - -	- - -	ИЕ-имму- ногенная единица
				«+» - склеенные эритроциты в виде «зонтика» «-» - отсутствие гемагглютинации -«пуговка»

Решение. Студент учитывает данные ему результаты, заполняет протокол и делает выводы:

1. Напряженный антитоксический иммунитет к дифтерии выявлен только у школьника А., так как по результатам РИГА в сыворотке крови обследуемого обнаружен высокий титр антитоксических антител (1/400).

2. Обследуемым детям Б. и Е., у которых не выявлен напряженный иммунитет, необходимо провести вакцинопрофилактику путем введения дифтерийного анатоксина, для того чтобы создать напряженный антитоксический иммунитет.

3. Объяснить причину заболевания одной из учениц в школе можно отсутствием у ней напряженного антитоксического иммунитета против дифтерии. Возможные причины: врожденный иммунодефицит, вторичный иммунодефицит, слабая экспрессия генов иммунного ответа, отсутствие вакцинации.

Подпись преподавателя_________________________________________________________

Теоретическая справка

К работе № 2

К работе № 3

К работе № 4

Серодиагностика дифтерии

Антитела к С. diphtheriae определяют в крови больных, начиная с первых дней болезни и повторно через 10-14 дней. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках. Диагностическое значение имеют результаты серологических исследований при нарастании титра антител не менее чем в 3-4 раза.

Для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке человека применяют несколько реакций:

РПГА

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином) и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты.В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

В нашей странеРПГА рекомендована в качестве основного метода для определения напряженности антитоксического иммунитета к С. diphtheriae, а также для оценки вакцинального иммунитета.

Оценка состоянияколлективного иммунитета требует более детальной характеристики, чем только установление процента серонегативных людей. Для этого следует давать развернутыепо каждому титру данные в РНГА т.е. с учетом степени напряженности. Отсутствие антител является безусловным показателем незащищенности; титры 1:10 и 1:20 можно считать индикатором пограничного иммунитета, не обеспечивающего безусловной защиты; однако заболевание при этом, как правило, протекает в легкой форме без летального исхода. Титры 1:80 и выше являются показателем защищенности группы.

Таким образом, процентное распределение показателей титров в каждом разведении дает качественную характеристику состояния иммунитета к дифтерии в обследованной группе. Например, выявление у 50% обследованных показателей пограничного иммунитета (титры 1:10, 1:20) свидетельствует о слабой защищенности группы, в которой с годами будет увеличиваться число лиц, не защищенных от дифтерии.

В настоящее время приняты следующие количественные критерии, характеризующие степень восприимчивости к дифтерии в зависимости от уровней антитоксических антител.

Содержание антитоксических антител	Интерпретация результатов
< 0,01МЕ/мл	обследуемый восприимчивк дифтерии
0,01 МЕ/мл	минимальный уровень циркулирующих антител, обеспечивающий некоторуюстепень защиты
0,01-0,09 МЕ/мл	уровни циркулирующих антитоксических антител, обеспечивающие некоторуюстепень защиты
0,1 МЕ/мл	защитный уровень циркулирующих антител
> 1,0 МЕ/мл	уровень антитоксина, обеспечивающий стойкуюдлительную невосприимчивость к дифтерии

ИФА

ИФА предназначен дляколичественного определения антибактериальных и антитоксических иммуноглобулинов М, G человека в сыворотке крови больных дифтерией, бактерионосителей издоровых людей. Принцип ИФА основан на образовании специфического комплекса антиген-антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена. При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по появлениюокрашенного продукта. Интенсивность реакции учитывается с помощью иммуноферментного анализатора или визуально.

3.Определение титра антител к дифтерийному токсину в сыворотке крови человека в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток.

Метод основан на том, что метаболическая активность и рост клеток культуры ингибируется дифтерийным токсином, который, в свою очередь, может быть нейтрализован антитоксином, содержащимся в сыворотке крови. Последовательное разведение сыворотки крови человека добавляют в лунки микропланшета, в которые затем вносят дифтерийный токсин в рабочей дозе и культуру клеток. Обнаружение по окончании инкубации (t 37^оС 5-6 суток) живых клеток культуры в лунках, содержащих определенные разведения сывороток, будет указывать на соответствующий титр антител к дифтерийному токсину в тестируемых сыворотках + проба на токсигенность.

К работе № 5

К работе № 7

К работе № 8

Серодиагностика

Для выявления специфических антител к антигенам микобактерий предложено большое количество серологических реакций: РПГА, РА, РСК.

В последние годы интенсивно разрабатываются тесты на выявление антител к МБТ в крови больного в конкурентной иммуноферментной реакции с применением стандартных концентраций антигена микобактерий и моноклональных антител, конъюгированных с ферментом - пероксидазой. Разработаны диагностические тест-системы "ИФА - туберкулез", предназначенные для выявления с помощью иммуноферментного анализа антител к МБТ и позволяющие распознавать как легочные, так и внелегочные формы туберкулеза. Тест-система "ИФА-туберкулез" может быть использована как для диагностики у отдельных больных, так и при массовых обследованиях населения. Чувствительность тест-системы при различных локализациях туберкулезного процесса составляет от 68% до 100%, специфичность - 94%.

К работе № 9

Занятие № 2.2.2

Дифтерия и туберкулез. Лабораторная диагностика

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Характеристику биологических свойств возбудителей дифтерии.

2. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при дифтерии.

3. Основные клинические проявления дифтерии

4. Характеристику биологических свойств возбудителей туберкулеза.

5. Эпидемиологию, патогенез, восприимчивость и иммунитет при туберкулезе

6. Основные клинические проявления туберкулеза.

7. Принципы лабораторной диагностики.