Изучение биохимических свойств.
Для идентификации культур, т.е. установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных признаков изучают биохимические, антигенные и другие свойства.
Биохимические свойства выделенных микроорганизмов изучают на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При микроскопии обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Специальными окрасками выявляют споры, капсулы, включения и жгутики.
Из колоний готовят мазки, затем окрашивают по Граму.
Техника окраски по Граму:
1) на обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют под пламенем горелки;
2) мазки окрашивают в течение 1 мин генцианвиолетом;
3) препарат промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2 сек.;
4) окрашивают препарат раствором Люголя в течение 1 мин.;
5) промывают препарат слабой струей водопроводной воды;
6) погружают препарат на 30 сек в 96%-ный спирт, взбалтывая последний, после чего препарат подсушивают промокательной бумагой;
7) окрашивают мазки раствором фуксина Пфейфера в течение 30 сек.;
8) промывают препарат в слабой струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, подсушивают промокательной бумагой и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а грамотрицательные в красный.
Метод раздавленной капли
Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.
Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.
Метод висячей капли
Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху.
Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.
К биохимическим свойствам относятся:
· Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т.е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующихся при расщеплении углевода кислоты и индикатор измеряет окраску среды. Поэтому эти среды называют «пестрый ряд». Микробы не ферментирующие данный углевод растут на среде не изменяя её. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах. «Поплавок» - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, который до стерилизации помещают в пробирку со средой.
Кроме того, сахаралитическую активность изучают на средах эндо, ЭМС, Плоскирёва. Бактерии сбраживая до кислоты находящихся в этих средах молочный сахар (лактозу) образуют окрашенные колонии – кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментатирующих лактозу, бесцветны.
Молоко при росте микробов ображивающих лактозу свёртывается. При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя – цвет среды не изменяется. Нерасщеплённый крахмал даёт с этим раствором синее окрашивание.
· Протеолитические свойства – ( т.е. способность расщеплять белки, полипептиды и т.п. ) их изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде, микробов ферментатирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен. Микробы, расщепляющие козеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока – оно приобретает вид молочной сыворотки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают нарезают узенькими полосками длиной 5-6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата – бумажка чернеет ; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.
Помимо указанных сред, способность микроорганизмов расщеплять различные питательные субстраты определяют с помощью бумажных дисков, пропитанных определёнными реактивами. Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 часа инкубации в термостате при температуре 37 градусов по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т.д.
· Гемолитические свойства – (способность разрушать эритроциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.
День 4.
Учет результатов.
Изучение морфологии, подвижности, тинкториальных свойств (см. главу 3),характера роста на средах (культуральные свойства), ферментативной активности и ряда других особенностей выделенного микроба позволяет установить его таксономическое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: определить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это называется идентификацией. Идентификация микроорганизмов очень важна при диагностике инфекций, установлении источников и путей ее передачи и в ряде других научно-практических исследований.
Для идентификации используют только чистую культуру.
В идентификации 4 этапа:
1) Выделение бактерий из исследуемого материала
2) Изучение изолированных колоний. Накопление чистой культуры
3) Изучение чистой культуры( идентификация)
4) Учет результатов
День 5.
Дезинфекция и стерилизация.