Правила Техники Безопасности.

День 1

Правила Техники Безопасности.

1. Находиться и работать в лабораторных халатах, колпаках и сменной обуви.

2. Пользоваться только отведенным рабочим местом и оборудованием, как меньше ходить по лаборатории.

3. Не выносить материал, посуду, оборудование из лаборатории.

4. Не принимать пищу в лаборатории.

5. После работы с заразным материалами, инструментами, посудой, предметными стеклами- подлежат обеззараживанию в дезинфицирующем растворе, либо в автоклаве, либо в пламени спиртовки.

6. Если разобьется посуда или разольется жидкость, содержащая заразный материал, необходимо сообщить об этом руководителю и тщательно все продезинфицировать.

7. Соблюдать чистоту и опрятность. До и после работы необходимо мыть руки и дезинфицировать стол.

Этап бактериологического исследования.

Первый этап заключается в изучении морфологических свойств.

По морфологии м.о. делятся на

Шаровидной формы — кокки;

Патогенные:

v диплококки (парные кокки) – клетки делятся в одной плоскости располагаются попарно к ним относятся плацентавидные пневмококки.

v стрептококки (цепочки кокков) - деление осуществляется в одной в плоскости, размножающийся клетки сохраняют связь не расходятся, образуя цепочки.

v стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев) – располагаются в виде грозди винограда т.к. деление клетки происходит в различных плоскостях.

v ганнококки и менингококки (бобовидной формы)

Все патогенные кокки вызывают гнойно- воспалительные заболевания.

Непатогенные:

v микрококки (отдельно лежащие кокки) – клетки делятся в разных плоскостях и располагаются по одиночке.

v тетракокки (образования из четырех кокков) – деление происходит взаимноперпендикулярных плоскостях.

v сарцины (паке­ты из 8 или 16 кокков) – деление клетки происходит в взаимноперпендикулярных плоскостях.

Палочковидные бактерии -располагаются в виде оди­ночных клеток, представители- клостридии (анаэробные, спорообразующие палочки) и бациллы (спорообразующие палочки).

Извитые формы

v спириллы (имеют 2-3 завитка (непатогенные)) -

v вибрионы (напоминают запятую) (представитель - холерный вибрион)

v спирохеты (имеют различное число завитков)

Классификация сред

По исходным компонентам:

v натуральные среды — готовят из продуктов животного и растительного происхождения(мясо, асцит, костная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.)

v синтетические среды — готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.

По консистенции (степени плотности):

v жидкие (бульоны)

v полужидкие

v плотные

Плотные и полужидкие среды отличаются от жидких наличием желирующего агента (агар-агар, реже желатин). Кроме того, в качестве плотных сред применяют коагулировавшие яичные или сывороточные белки, картофель, среды с силикагелем. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается.

По составу:

v простые — мясопептонный бульон(МПБ), мясопептонный агар(МПА), питательный желатин,

v сложные — многокомпонентные среды, которые могут содержать аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие вещества.

По назначению:

v основные — служат для культивирования большинства микроорганизмов, например МПБ, МПА, бульон, шоколадный агар, пептонная вода.

v специальные — служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах.

v элективные(избирательные) — служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Среды становятся элективными при добавлении к ним определённых антибиотиков, солей, изменения pH. Жидкие элективные среды называют средами накопления.

v дифференциально-диагностические — позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности.

v транспортные — предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала.

Этапы приготовления:

1. Варка

2. Установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром или компаратором. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.

3. Осветление: производят, если при варке среды мутнеют или темнеют. Для этого используют белок куриного яйца или сыворотку крови.

4. Фильтрация: жидких и расплавленных желатиновых сред производят через влажный бумажный или матерчатый фильтры. Фильтрация агаровых сред затруднена — они быстро застывают. Обычно их фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

5. Разлив: разливают среды не более чем на ¾ ёмкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

6. Стерилизация: режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте.

7. Контроль.

Приготовление МПА

1) Взвешать 2,5 сухого питательного агара

2) Растворить в 100мл воды

3) Прокипятить до полного растворения агара (2 мин), постоянно мешая

4) Проверить pH среды (нейтральная).

5) Профильтровать горячую среду через ватно – марлевый фильтр

6) Разлить в пробирки по 5 – 7 мл

7) Простерилизовать при температуре 120^о

Приготовление среды Эндо

1) 4 г сухого агара Эндо растворить в 100 мл воды

2) Прокипятить, не допуская пригорания

3) Проверить pH(7,3)

4) Профильтровать горячую среду

5) Простерилизовать при t=110^о в течении 20 мин

6) Разлить в стерильные чашки Петри. Чашки нельзя оставлять на свету.

День 2

2 этап бактериологического исследования.

День 3

Метод раздавленной капли

Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предмет­ное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть та­кой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рас­сматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод висячей капли

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры нано­сят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предмет­ное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают по­кровным стеклом кверху.

Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

К биохимическим свойствам относятся:

· Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т.е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующихся при расщеплении углевода кислоты и индикатор измеряет окраску среды. Поэтому эти среды называют «пестрый ряд». Микробы не ферментирующие данный углевод растут на среде не изменяя её. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах. «Поплавок» - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, который до стерилизации помещают в пробирку со средой.

Кроме того, сахаралитическую активность изучают на средах эндо, ЭМС, Плоскирёва. Бактерии сбраживая до кислоты находящихся в этих средах молочный сахар (лактозу) образуют окрашенные колонии – кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментатирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов ображивающих лактозу свёртывается. При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя – цвет среды не изменяется. Нерасщеплённый крахмал даёт с этим раствором синее окрашивание.

· Протеолитические свойства – ( т.е. способность расщеплять белки, полипептиды и т.п. ) их изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде, микробов ферментатирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен. Микробы, расщепляющие козеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока – оно приобретает вид молочной сыворотки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают нарезают узенькими полосками длиной 5-6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата – бумажка чернеет ; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Помимо указанных сред, способность микроорганизмов расщеплять различные питательные субстраты определяют с помощью бумажных дисков, пропитанных определёнными реактивами. Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 часа инкубации в термостате при температуре 37 градусов по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т.д.

· Гемолитические свойства – (способность разрушать эритроциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

День 4.

Учет результатов.

Изучение морфологии, подвижности, тинкториальных свойств (см. главу 3),характера роста на средах (культуральные свойства), ферментативной активности и ряда других особенностей выделенного микроба позволяет установить его таксономическое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: определить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это называется идентификацией. Идентификация микроорганизмов очень важна при диагностике инфекций, установлении источников и путей ее передачи и в ряде других научно-практических исследований.

Для идентификации используют только чистую культуру.

В идентификации 4 этапа:

1) Выделение бактерий из исследуемого материала

2) Изучение изолированных колоний. Накопление чистой культуры

3) Изучение чистой культуры( идентификация)

4) Учет результатов

День 5.

Дезинфекция и стерилизация.

Сухожаровая стерилизация

Стерилизацию сухим жаром или горячим воздухом осуществляют в печах Пастера (сушильных сухожаровых шкафах).

Сухим жаром стерилизуют в основном лабораторную посуду при Т 160-165 °С и при этой температуре стерилизуют 1 ч.

Стерилизацию в печи Пастера можно проводить при различном температурном режиме и экспозиции (время стерилизации)

Жидкости (питательные среды, изотонический раствор хлорида натрия и др.), предметы из резины и синтетических материалов стерилизовать сухим жаром нельзя, так как жидкости вскипают и выливаются, а резина и синтетические материалы плавятся.

Стерилизацию паром производят двумя способами:

1) паром под давлением;

2) текучим паром.

1)Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Этот способ стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые материалы насыщенного водяного пара при давлении выше атмосферного. В результате такой стерилизации при однократной обработке погибают как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов.

Для проверки эффективности стерилизации в автоклав помещают пробирку с заведомо споровой культурой. После автоклавирования пробирку переносят в термостат на 24—48 ч, отмечают отсутствие или наличие роста. Отсутствие роста свидетельствует о правильной работе прибора.

2)Стерилизацию текучим паром производят в аппарате Коха. Этот способ применяют в тех случаях, когда % стерилизуемый объект изменяется при температуре выше 100 °С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, и содержащие мочевину, углеводы, молоко, картофель, желатин и др.

Дробную стерилизацию можно проводить также в свертывателе Коха.

Свертыватель Коха используют для свертывания сывороточных и яичных питательных сред, причем одновременно с уплотнением среды происходит ее стерилизация.

День 1

Правила Техники Безопасности.

1. Находиться и работать в лабораторных халатах, колпаках и сменной обуви.

2. Пользоваться только отведенным рабочим местом и оборудованием, как меньше ходить по лаборатории.

3. Не выносить материал, посуду, оборудование из лаборатории.

4. Не принимать пищу в лаборатории.

5. После работы с заразным материалами, инструментами, посудой, предметными стеклами- подлежат обеззараживанию в дезинфицирующем растворе, либо в автоклаве, либо в пламени спиртовки.

6. Если разобьется посуда или разольется жидкость, содержащая заразный материал, необходимо сообщить об этом руководителю и тщательно все продезинфицировать.

7. Соблюдать чистоту и опрятность. До и после работы необходимо мыть руки и дезинфицировать стол.