Культивирование первичных однослойных культур

Пер­вичные культуры клеток обычно выращивают в стеклянных со­судах, закрытых резиновыми пробками. При благоприятных условиях клетки прикрепляются к стеклу в течение нескольких часов. Они прикрепляются лучше к мягким сортам стекла, со­держащим больше ионов натрия, чем к твердым, типа пирекс. При физиологических значениях рН клетки заряжены отрица­тельно, и их связь с отрицательно заряженными центрами сте­кла может осуществляться с помощью двухвалентных катио­нов (главным образом Са⁺⁺). В процессе метаболизма клетки выделяют протоны, которые могут вытеснять двухвалентные катионы, в результате чего нарушается адгезия, т. е. способ­ность клеток культуры прикрепляться к твердому субстрату, например к стеклу. Возможно, ионы натрия являются своего рода антагонистами протонов и способствуют их удалению из центров связывания клеток со стеклом. Подобного рода меха­низм, по-видимому, действует и в случае прикрепления клеток к другим субстратам. По мере увеличения плотности клеточ­ной популяции адгезия клеток друг с другом возрастает, тогда как адгезия их с субстратом уменьшается.

Клетка прикрепляется к субстрату только ведущим и зад­ним краями. Между стеклом и прикрепленными к нему клетка­ми обнаружено расстояние примерно в 10 нм. Передний край фибробласта представляет чрезвычайно тонкую мембрану (ши­риной 5 — 10 мкм), которая совершает волнообразные движения от ведущего края назад со скоростью ⅓—½ мкм/с. Благодаря волнообразным контактам клеточной мембраны с субстратом движение присуще, по-видимому, также эпителиальным (эпителиоидным) и другим клеткам в культуре. Такие клетки за 1 ч могут переместиться на 133 мкм.

Обычно вслед за эксплантацией нормальных клеток на­блюдается период покоя. В течение этого периода клетки при­крепляются к стеклу, распластываются на его поверхности, но еще не вступают в стадию деления. В это время происходит адаптация клеток к условиям существования и подготовка к де­лению. Затем начинается размножение клеток. Скорость раз­множения клеток в культуре зависит от ряда факторов: исходной ткани, возраста животного, качества и рН питатель ной среды, количества клеток, температуры культивирования, а также от степени повреждения клеток в момент выделения ткани.

Оказалось, что далеко не все клетки, используемые при посеве, способны прикрепляться к стеклу и расти в однослойной культуре. Только 0,2% клеток, изолированных из тканей новорожденных мышей, были способны к росту в культуре. С воз­растом их количество постепенно снижалось. В селезенке и костном мозге морских свинок количество клеток, способных образовывать колонии, составило 10^-5. С возрастом значитель­но замедлялось и уменьшалось выселение клеток из эксплантированной ткани.

Клетки тканей взрослых животных прикрепляются к сте­клу в меньшем количестве, чем клетки эмбриональных тканей. С возрастом животного способность клеток различных тканей к росту в культуре меняется неодинаково. Основываясь на низкой высеваемости клеток, Сато (1960) и Царофф (1961) высказали предположение, что рост культуры происходит за счет спе­циальной категории клеток, составляющих меньшинство кле­точной популяции исходной ткани.

Суспензия ткани, дезагрегированной механическим спосо­бом, содержит ничтожно малый процент клеток, способных к росту на стекле. Зависимость результатов выращивания нетрипсинизированных клеток от возраста животных, по-видимо­му, объясняется тем, что клетки эмбриональных тканей или молодых животных не имеют достаточно выраженного поверх­ностного слоя и могут легко прикрепляться к стеклу и устанав­ливать необходимый для их роста обмен с культуральной сре­дой. Клетки почки эмбриона коровы росли одинаково хорошо до и после трипсинизации. Ростовая способность нетрипсинизированных клеток почки кролика находилась в обратной зави­симости от возраста животных. Нетрипсинизированные клетки 3 — 7-дневных кроликов образовывали монослой на 1—2 дня позже трипсинизированных клеток при одинаковых условиях выращивания. Клетки 10 —21-дневных кроликов, не обрабо­танные трипсином, образовывали изолированные зоны роста, а клетки более взрослых животных росли только вокруг кле­точных конгломератов, тогда как трипсинизированные клетки формировали монослой. Это свидетельствует о стимулирую­щем влиянии трипсинизации на рост клеток.

Однослойные культуры могут быть получены только при посеве определенного количества клеток на единицу поверхно­сти сосуда. Недостаточное количество клеток, так же как чрез­мерный избыток их, тормозит рост культуры. Для клеток мно­гих тканей оптимальная посевная концентрация находится в пределах 2 - 5 -10⁵ в 1 мл.

При выращивании первично-эксплантированных клеток применяют различные синтетические и полусинтетические среды. Для этих целей вполне пригодными оказались также среды, изготовленные на основе ферментативных гидролизатов белковых веществ. Из таких сред наибольшее распространение в вирусологической практике получила среда с гидролизатом лактальбумина.

Солевой раствор Хэнкса (или Эрда) с 0,5 % гидролизате лактальбумина (ГЛА), дополненный 2-10% сыворотки (чаше всего телят), оказался пригодным для получения однослойных культур трипсинизированных клеток различных тканей жи­вотных.

Несмотря на общие принципы выращивания свежеизоли­рованных клеток, в приготовлении однослойных культур кле­ток различных тканей животных имеются некоторые особенно­сти. Разработаны приемы, позволяющие наиболее эффективно получать и выращивать клетки различных тканей животных в первичной культуре.

В процессе массового производства клеточных культур ча­сто возникает необходимость в кратковременном хранении сус­пензии клеток. Температура 0—6°С оказалась более благо­приятной для сохранения жизнеспособности клеток почек обезьян по сравнению с 22 —24 °С и позволяет получить полно­ценную культуру в течение четырех дней хранения. Такие же условия были подходящими для хранения суспензии клеток по­чек телят. Через 24 ч хранения при 4 °С жизнеспособными оста­вались 70% клеток, через 48 ч - 60, через 72 ч - 50%, тогда как при 22°С - 44, 30 и 12% клеток соответственно. Клетки после хранения в течение трех дней образовали полноценный монослой. Измельченная ткань почек куриных эмбрионов или трипсинизированные клетки оставались жизнеспособными в питательной среде при 4°С в течение 10 дней, а трипсинизи­рованные клетки тертикул телят и поросят, хранившиеся в ро­стовой среде при 4 —5°С, сохраняли жизнеспособность 7 дней. Обычно для поддержания жизнеспособности клеток ис­пользуют те же среды, в которых выращивают клетки, но без сыворотки. Иногда применяют специальную поддерживающую среду.

Питательны среды сбалансированные солевые растворы, используемые для культивирования клеток

При кратковременном культивировании клеток основную роль играют такие факторы, как осмотическое давление, концентра­ция ионов водорода и других неорганических ионов, характер углевода и состав атмосферы. Растворы, в которых эти фак­торы сочетаются определенной комбинации, называются сбалансированными солевыми растворами. Все сбалансированные солевые растворы являются производными физиологического раствора, разработанного Рингером. В состав его входят три катиона: калии, кальций и натрий. Первым сбалансированным раствором, предназначенным для клеток млекопитающих, является раствор Тироде. В настоящее время широко приме­няют растворы Хенкса и Эрла. Раствор Эрла обладает свой­ствами сильного буфера благодаря высокой концентрации би­карбоната натрия. Раствор Хенкса составлен таким образом, что он уравновешивается воздухом, а не СО₂. Для орошения и промывания клеток используют фосфатный буферный рас­твор Дульбекко и Фогта. Этот раствор также приме­няют в качестве основы раствора трипсина.

Естественные среды. В качестве естественных питательных сред для культур клеток используют аллантоисную или амниотическую жидкость крупного рогатого скота с добавлением нормальной лошадиной сыворотки или эмбрионального эк­стракта, гомологичную сыворотку крови, куриную плазму и куриный эмбриональный экстракт. Наиболее распростра­ненный природный ингредиент питательных сред — гидролизат лактальбумина, получаемый при ферментативном гидролизе белка молока. Среду, предложенную Мельником для культиви­рования клеток почки обезьяны и состоящую из раствора Эрла, гидролизата лактальбумина и сыворотки, с успехом приме­няют для культивирования первичных культур многих тканей.

Для обогащения сред с частично определенным химиче­ским составом часто используют другой продукт переварива­ния белка — триптозо-фосфатный бульон.

Среды из химически определенных веществ с добавлением естественных компонентов. Наиболее широко используемой средой такого типа является среда Игла, в состав которой входяг раствор Эрла, тринадцать ампнокнслог, семь витаминов и 5-10% сыворотки крупного рогатого скота для культур кле­ток или сыворотка другого происхождения.

Среда 199 широко и успешно применяется как поддержи­вающая среда, а при добавлении сыворотки - как ростовая среда. Эта чрезвычайно сложная среда содержит почти все аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеи­новых кислот, дополнительные факторы роста, источники ли-пндон и раствор Эрла с добавлением азотнокислого железа. Позднее среду 199 модифицировали, и она получила название среда 858. Эта среда значительно эффективнее среды 199. Бла­годаря увеличенному количеству восстановителей (гидрохлори­стого 1-цистеина, аскорбиновой кислоты и глютатиона) ее окислительный потенциал приближен к физиологическому уровню.

Поддерживающие среды предназначены для сохранения клеточных культур в хорошем состоянии в течение нескольких дней, недель с тем, чтобы свойства клеток оставались неиз­менными. Рост клеток должен быть максимально снижен, одна­ко чувствительность к вирусам должна полностью сохраняться. Во многих случаях для этого достаточно снизить концентра­цию сыворотки в среде или исключить сыворотку полностью.

Ход работы

Метод теплой трипсинизации используют для дисперги­рования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 — 5 мм, ткань многократно (3—4 раза) промывают физиологического раствора до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добавляют 0,25%-ный раствор трипсина, в которой перемешивают ткань 10 — 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают, а к ткани добавляют, свежую порцию 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:10-20. Температура раствора может варьировать от комнатной до 37°С.. Дезагрегацию ткани ферментом повторяют 2-3 раза;

в) последнюю экстракцию сливают в пенициллиновый флакон, клетки осаждают в течение 10-15мин;

г) осадок клеток собирают (с помощью пипетки) со дна флакона стараясь не захватывать крупные агрегаты ткани и определяют концентрацию клеток в суспензии.

Значительно реже для дезагрегации клеток используют ме­ханический способ.

Определение концентрации клеток. Для приготовления по­севной концентрации клеток необходимо вначале определить их концентрацию в исходной суспензии. Подсчет клеток про­изводят в счетных камерах различных систем (Горяева, Спенсе­ра, Бюркера, Тома, Фукс-Розенталя и др.). Для подсчета отби­рают пробу после тщательного перемешивания суспензии клеток. Для дифференциации живых и мертвых клеток исполь­зуют витальные красители: метиленовую синь или нейт­ральный красный. Подсчитывают количество живых клеток в 3 — 4 камерах (увеличение микроскопа: окуляр 7, объектив 20 по всей площади камеры, четырехкратно, каждый раз, заряжая камеру вновь, причем, во внимание берутся только те клетки, которые расположены в камере, в границах, очерченных сеткой – 225 больших квадратов), определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию клеток в 1 мл по формуле, соответствующей дан­ной системе камеры, например для камеры Горяева:

где 100- количество кубических миллиметров в 1 cм; а - количество клеток в камере; н - разведение клеточной суспензия; 0,9 - объем камеры Горяева в мм³

При использовании счетных камер других их систем в лааной формуле необходимо заменить знаменатель - объем камеры.