Изучение влияния различных температур на рост и развитие популяции микроорганизмов

ВВЕДЕНИЕ

Лабораторный практикум по экологии микроорганизмов предназначен для студентов, обучающихся по специальности 012400 "Микробиология".

Целью лабораторных занятий по экологии микроорганизмов - помощь в самостоятельной работе студентов при освоении теоретического курса и ознакомление с методами, используемыми при изучении микроорганизмов в природе.

Каждая лабораторная работа содержит краткое содержание, перечень лабораторных материалов и оборудования для проведения эксперимента, описание хода работы и методик при постановке опытов.

Предлагаемая форма подачи материала заставляет студента думать, самостоятельно воспроизводить и наблюдать в лабораторных условиях микробиологические процессы, происходящие в природе.

Методические указания предполагают самостоятельную подготовку студентов к каждому занятию. Вопросы для самоподготовки приведены в начале соответствующей темы. Контроль знаний студентов осуществляется путем письменного решения тестовых заданий и устного собеседования с преподавателем по каждой теме.

Для подготовки к зачету даны вопросы по дисциплине «Экология микроорганизмов» в приложении А.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ЗАНЯТИЯ

1. Введение – 5 минут.

2. Письменный контроль исходного уровня знаний (решение тестовых заданий) – 15 минут.

3. Собеседование по вопросам самоподготовки и коррекция знаний – 45 минут.

4. Самостоятельная работа – 65 минут.

5. Подведение итогов занятия –3 минуты.

6. Сбор отчетов (альбомов) для проверки преподавателем – 2 минуты.

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ

При выполнении лабораторных работ необходимо неукоснительно соблюдать общепринятые правила безопасного обращения с кислотами и щелочами, лабораторной стеклянной посудой (предметными и покровными стеклами, пипетками, чашками Петри, пробирками и др.), колющими и режущими инструментами (скальпелями, препаровальными иглами и др.), электрооборудованием (осветителями); соблюдать осторожность при использовании открытого огня (спиртовки); не допускать пролива и возгорания легковоспламеняющихся жидкостей (этилового спирта, эфира).

ТЕМА 1

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ПОПУЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цели занятия:

· Изучить влияние различных температур на рост и развитие единичных клеток, и популяцию микроорганизмов.

· Изучить особенности морфологического строения колоний и клеток микроорганизмов.

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Определите научные предпосылки возникновения экологии микроорганизмов

2. В чем сущность микробиологического принципа Виноградского-Бейеринка

3. Методы экологии микроорганизмов

4. Основные направления экологии микроорганизмов

5. Аутэкология

6. Демэкология

а) характеристика популяции

б) взаимодействие популяций

7. Синэкология

8. Характеристика экосистем

9. Устройство микроскопа

10. Методы хранения микроорганизмов

11. Окрашивание препарата. Методы окраски.

Оборудование и материалы:

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Питательные среды в пробирках: МПА косой, МПА прямой, МПБ, МПЖ, молоко, косяки картофеля.

5. Чашки Петри с культурами микроорганизмов.

6. Микробиологические петли и иглы.

7. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями, 1%-ный водный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета, раствор Люголя, склянка с 95%-ным этанолом, 0,1%-ный раствор фуксина).

Общие сведения

В природе микробные сообщества растут, образуя биопленки, о чем впервые сообщили К.Зобэлл и М.Андерсон еще в 50-х го­дах XX столетия, однако документированные подтверждения уни­кальности проходящих там процессов были получены лишь в последние 20 лет благодаря в основном развитию техники микро­электродов.

Колонии практически всех видов бактерий демонстрируют способность к клеточной дифференцировке и многоклеточной организации. Эта способность наиболее очевидно проявляется при росте бактерий в их природных местах обитания, где они формируют различные многоклеточные структуры: биоплёнки, бактериальные маты, плодовые тела и др.

В настоящее время общепринято, что при развитии в природе биопленки преобладают над свободноживущими микро­организмами как в численном отношении, так и по уровню мета­болизма. Доказано, что клетки в составе биопленки фенотипически отличаются от свободноживущих и что способностью к обра­зованию биопленок обладают все представители домена бактерий. Тесные структурные ассоциации клеток в составе биопленок ве­дут к интенсивному обмену метаболитами (химическая коммуни­кация) и, возможно, генетическим материалом, что может при­водить к адаптивной изменчивости функций всего сообщества.

Понятие «ощущение кворума» (Quorum Sensing) было предложено в 1994 году. Оно означает восприятие клетками изменений среды, которые наступают при достижении бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения.

Распространяющиеся химические сигнальные молекулы составляют один из немногих механизмов, с помощью которого бактерии могут взаимодействовать друг с другом. Восприятие таких сигналов возможно отдельной бактериальной клеткой, чтобы воспринять как себя так и другие клетки, и таким образом адаптироваться к окружающей среде в соответствии с плотностью популяции. Это клеточная коммуникация стала называться «Quorum Sensing». Предполагается, что экспрессия генов, регулирующих плотность клеточной популяции регулируется, сигнальными молекулами, взаимодействующими с чувствительными рецепторами или регуляторными белками транскрипции. «Quorum Sensing», таким образом, пример мультиклеточного поведения, способный модулировать целый ряд физиологических процессов, включая:

· биолюминесценцию у морских бактерий Vibrio fisheri и V.harveyi;

· агрегацию клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых тел со спорами;

· споруляцию у бацилл и актиномицетов;

· стимуляцию роста у стрептококков и ряда других микроорганизмов;

· конъюгацию с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных видов, а также у бактерий рода Agrobacterium;

· синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у патогенов растений (Erwinia carotovora, E.hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus);

· образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у E.carotovora;

· формирование биоплёнок у Р. aeruginosa и других микроорганизмов.

Раскрыты механизмы многих из указанных процессов, определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от плотности популяции.

Серьёзной проблемой клинической практики является широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибактериальных препаратов. Особенную трудность представляет повышенная лекарственная устойчивость бактерий в биоплёнках. Для синтеза факторов вирулентности, антибиотиков и формирования биоплёнок бактерии часто используют реакции кворум-сенсинга. Поэтому изучение механизмов таких реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами, а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов.

Ход работы

1. Готовые чашки Петри с плотной питательной средой на основе ферментативного гидролизата мяса промаркировать с указанием значения показателя высеваемой концентрации клеток, температуры и фамилии студента.

2. Определить оптическую концентрацию бактерий в суспензии по стандарту мутности ГИСК.

3. Выполнить посев микробной суспензии Proteus mirabilis на плотную питательную среду ( из разведения 10^-6 ), затем чашки поставить в термостат и инкубируют при температуре 7° и 27±2°С. Чашки засеянные микробной суспензией сплошным «газоном» инкубировать при температуре 7±2°С.

4. По истечении 2 суток на чашках с культурами бактерий, инкубируемых при температуре 27±2°С описать колонии по следующей схеме:

- диаметр колонии – точечные (D – меньше 1 мм), мелкие (D – 1-2 мм), средние (D – 2-4 мм), и крупные (D – 4-6 мм и более).

- форма колонии - округлая, амебовидная, ризоидная.

- оптические свойства – прозрачная, матовая, флуоресцирующая, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая.

- цвет – отмечают цвет колонии и выделение пигмента в среду.

- поверхность – гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая.

- профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, врастающий в агар и т. д.

- край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и т. д.

- консистенция – маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая.

При описании края и структуры колонии чашки Петри не открывая, помещают под микроскоп дном вверх.

5. Морфологию бактерий изучить из отдельной колонии. Произвести окрашивание по Граму. Окрашенный препарат микроскопировать, пользуясь объективом ВИ-40; мазок рассмотреть с объективом МИ-90. Просматривая препараты, зарисовать микроорганизмы, обращая внимание на форму, взаимное положение клеток и на соотношение размеров бактерий при разном увеличении микроскопа; определить отношение к окраске по Граму. Подсчитать количество колоний на чашке.

6. Через 5 суток культуру, инкубируемую при температуре 7±2°С проанализировать: в случае выявления сплошного роста на чашках Петри, засеянных «газоном», определить концентрацию микробных клеток путем смыва с помощью стеклянного шпателя в минимальном объеме физиологического раствора (2-3 см³) и определить морфологию бактерий, как описано выше. На чашках засеянных микробной суспензией с целью выявления единичных колоний в случае обнаружения роста изучить колонии по вышеприведенной схеме и оценить морфологию бактерий из колоний.

ТЕМА 2

Общие сведения

Почвенный покров бесспорно является основным депо раз­нообразных бактерий на Земле. Некоторые бактерии являются типичными обитателями почвы и обычно не обнаруживаются в водной среде или в составе микрофлоры макроорганизмов. Это, например, многие представители порядков Actinomycetales и Myxobacteriales. С другой стороны, для микрофлоры почвы не­характерны спирохеты, виды бактерий, снабженных газовыми вакуолями, метанобразующие бактерии и многие другие ана­эробы. Своеобразием микрофлоры почвы является то, что здесь всегда присутствуют клетки, для которых почва вообще не яв­ляется местом активного развития, или такие клетки, развитие которых может происходить лишь в редкие и случайные перио­ды обогащения почвы подходящим субстратом. Для микроор­ганизмов целинных почв таким случайным субстратом может быть навоз. Его попадание в почву вообще закономерно, но для данного пространственно ограниченного участка это событие вообще может никогда не произойти.

Почва представляет собой весьма гетерогенную среду. В каждой конкретной почве складываются своеобразные микроб­ные ценозы, однако в соответствии с природой почвы как эле­мента биосферы эти ценозы всегда имеют определенную струк­туру.

На xv Международном конгрессе почвоведов, состоявшемся в Мексике в 1994 г., был проведен специальный симпозиум, посвященный проблеме оценки бактериального разнообразия почв. Среди принимавших участие ученых была высказана надежда, что в ближайшее время будет выработана программа исследований почв как генератора биологического разнообразия Земли.

В настоящее время ряд ученых (Добровольских Г.В., Звягинцев Д.Г.) обращают внимание на недооценку роли почвы как среды обитания и сохранения всего разнообразия жизни на планете и почвенных микроорганизмов, как жизненно необходимых для функционирования и саморегулирования экосистемы Земли и ее биосферы и перечисляют главные вопросы, на которые следует ответить в будущем почвенным микробиологам:

1. Как могут существовать в 1 г почвы так много видов (до 4 тыс.) и популяций микроорганизмов?

2. Как связана структура почвенного бактериального сообщества со структурой микробного сообщества в целом?

Отсутствие ответов на вопросы, которые были поставлены очень давно, связано, прежде всего, с ограничением методов почвенной микробиологии. Учет микроорганизмов может быть произведен методами прямого микроскопического счета, чашечным методом посева почвенной суспензии на питательные среды, методом мультисбстратного тестирования (метаболический потенциал сообщества), анализом профилей метиловых жирных кислот, различными модификациями молекулярно-биологических методов. Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки.

Ход работы

1. Подготовка материала для анализа

1.1. Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ров­ный, волнистый, склон), степени гетерогенности почвы и ее од­нородности в ботаническом отношении. Рекомендуют с площа­ди 100 м² брать пробу из трех точек; с площади, превышающей 100 м², — из пяти по принципу конверта (четыре в точках по уг­лам и одну — ближе к центру прямоугольника); с 1 га и более — из 15 точек. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний слой толщиной 2 см.

Почвенный образец берут буром, лопатой и ножом. В поле перед взятием образца их тщательно очищают, затем обрабатывают спиртом и обжигают. Можно ограничиться очи­сткой этих предметов, если затем несколько раз воткнуть их в почву изучаемого горизонта. Укладывают образец в, заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную бан­ку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной бумагой, либо в стерильные пергаментные пакеты или пакеты из плотной бумаги. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, гори­зонта и других сведений.

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. При необходимости допускается хранение их в холодном помеще­нии (в холодильнике) в течение двух дней. Для придания сред­нему образцу большей однородности, соблюдая все условия асептики, тщательно перемешивают почву, вынимают корни растений, различные включения.

2. Приготовление почвенной суспензии

Образцы почв отбирают с пробной площади по 3-5 образцов (рис. 1) весом по 100-200 г в стерильные пергаментные пакеты. Перед подсчетом необходимо добиться, чтобы клетки в суспензии находились в виде

Рис. I. Схема сбора образцов с опытных участков

одиночных свободноплава­ющих клеток. Для выполнения этого условия необходимо осущест­вить три процесса:

1) диспергирование почвенных агрегатов;

2) десорбцию клеток микроорганизмов с почвенных частиц;

3) разделение микроколоний на отдельные составляющие их клетки.

Эти процессы осуществляются одними и теми же приемами:

1) увлажнение почвы до состояния пасты при растирании ре­зиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке 5 мин.

2) обработка на микроизмельчителе тканей РГ-2 5 мин. при 500 об/мин (10 г почвы +90 мл воды)

3) обработка ультразвуком низкой частоты УЗДН-1 (3 мин. при силе тока 0,40 А, частота 15 кГц) (10 г почвы + 90 мл воды)

Рис. 2. Схема последовательных разведений почвы

Для учета микроорганизмов широкое распространение получили:

1) прямые микроскопические методы учета микроорганизмов;

2) учет численности микроорганизмов методом посева на твердые питате­льные среды.

Недостатком первого метода является невозможность разгра­ничить живые и мертвые клетки микроорганизмов. В силу этого данные, полученные по этому методу, превышает фактическое со­держание микроорганизмов в почве. Вторым методом же, наоборот, удается учесть только незначительную часть (0,1-1%микро - населения почвы из-за отсутствия универсальной среды, пригодной для выявления всех живых микроорганизмов почвы.

1) Прямой микроскопический метод учета микроорганизмов. Метод Виноградского в модификации Шульгиной чаще применяют в лабораторной практике. Сущность его в следую­щем. Из средней почвенной пробы берут 5 г и вно­сят в колбу Эрленмейера на 250 мл, содержащую 50 мл сте­рильной водопроводной воды. Навеску почвы предварительно растирают в стерильной агатовой или фарфоровой ступке с не­большим количеством стерильной воды. Для черноземных и темно-каштановых почв навеску растирают с 0,1%-ным рас­твором пирофосфата натрия. Затем 5 мин встряхивают и в те­чение 2—5 мин дают осесть грубым частицам.

Из полученной взвеси стерильной градуированной пи­петкой берут 0,01 мл и переносят на хорошо обезжиренное стекло. Предварительно на предметном стекле расчерчивают квадрат площадью 4 см². Нанесенную взвесь равномерно распределяют по поверхности. После того, как мазок высохнет, его заливают раствором 0,1%-ного агара (хорошо отмытый агар готовят на дистиллированной воде) и снова высушивают. Покрытый агаром препарат фиксируют 96%-ным спиртом и красят карболовым эритрозином (от 40 мин до одних суток). При ок­рашивании стекла краситель наносят на препарат предварительно покрытым фильтровальной бумагой. Остаток красителя смывают, опуская стекла в воду тыльной стороной. Затем препарат снова сушат и просматривают под микроско­пом с иммерсионной системой.

Для получения более точных результатов подсчитывают 10 полей зрения и определяют среднее число клеток в одном поле зрения. Одновременно устанавливают площадь поля зре­ния: р = pr². Диаметр поля зрения измеряют при по­мощи объектного микрометра. Затем находят, сколько полей зрения (К) размещается на площади мазка (Р), равной 400 мм² по формуле:

Пример расчета: Если диаметр поля зрения равен 0,16 мм, а площадь поля зрения соответствует 0,02 мм², то

Среднее число клеток в поле зрения умножают на К и устанавливают число клеток в 0,01 мл суспензии. Для оп­ределения количества клеток в 1 мл суспензии полученное число умножают на 100, для подсчета в 1 г абсолютно сухой почвы — на степень разведения и делят на навеску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Использование метода прямого учета почвенных микро­организмов по Виноградскому в модификации Шульгиной по­казало, что в почве содержится в сотни и тысячи раз больше клеток микроорганизмов, чем удается учесть методом пита­тельных пластин.

2) Учет численности микроорганизмов методом посева на плотной питате­льной среде.

После предварительной подготовки почвы по схеме, указан­ной выше (рис. 2), производят посев в чашки Петри со специа­льными питательными средами. Посев производят из разведений от 1:2 до 1:10000, в зависимости от групп учитываемых микро­организмов, типа почвы, сезона, влажности и т.п. Наиболее то­чный подсчет получается, если на чашке развивается 50-200 ко­лоний бактерий и актиномицетов и 30-50 колоний грибов.

При первых анализах трудно предвидеть, сколько микроор­ганизмов содержится в почве, поэтому делают посев из двух или даже трех последовательных разведений. Для учета грибов и дрожжей берут разведения на 1-2 порядка меньше, чем для уче­та бактерий и актиномицетов.

Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Бактерий подсчитывают через 3 суток.

В чашках Петри сначала учитывают колонии в 100 полях зрения, затем определяют среднее арифметическое для одного поля зрения. Для определения числа колоний на всей чашке среднее число колоний в одном поле зрения умножают на ко­эффициент (К), который равен площади чашки Петри (Р), де­ленной на площадь поля зрения (р):

Диаметр чашки Петри измеряют линейкой, а диаметр поля зрения — под микроскопом, используя для малых увели­чений миллиметровую бумагу, а для больших (объективы 40 х и 90х) — объективный микрометр.

Подсчитав при поверхностном посеве число колоний на чашке, находят содержание клеток в 1 мл соответствующего разведения, умножая число колоний на 20, так как посеяно было 0,05 мл суспензии. Чтобы определить количество клеток в 1 г сырой почвы, их содержание в 1 мл умножают на степень разведения (10³, 10⁴, 10⁵ и т. д.).

Для учета микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы число клеток в 1 г сырой почвы делят на количество абсолют­но сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример расчета. Установлено, что при поверхностном посеве почвенной суспензии из разведения 10^-3 число колоний на чашке равно 52; влажность почвы — 25%; при такой влажности 1 г сырой почвы содержит 0,75 г абсолютно сухой почвы. Число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы (х) определяют следующим образом:

ТЕМА 3

Метаногенное сообщество

2. Сульфидогенное сообщество

3. Аноксигенное фототрофное сообщество

4. Бактериальный окислительный фильтр и изотрофы

5. Аэробное сообщество

6. Сообщество и филогения

Общие сведения

Если в цианобактериальных матах и наземных водорослевых корочках весь бактериальный комплекс сконцентрирован в 1-сантиметровом слое (хотя и разделенном на ярусы), то с появ­лением высших растений произошло пространственное разобще­ние бактерий в связи с их расселением по различным органам растений, иногда значительно удаленным друг от друга. Пос­кольку каждый из органов растений представляет особую эконишу по отношению к поселяющимся там микроорганизмам, были предложены термины, определяющие эти ниши. Филлосфера - надземные части растений, ризосфера - подземные, геммисфера - почки растений, спермосфера - семена. Впоследствии для более четкого отделения поверхности листьев и корней от зон, прилегающим к ним, появились термины "филлоплана" и "ризоплана" - под которым подразумевают только то, что находится непосредственно на поверхности корня и прикреп­лено к корню. Бактерии обнаруживаются также на цветах, ягодах, пло­дах и даже в сокотечении растений.

Освоение бактериями экониш, связанных с прижизненными выделениями растения, происходило не только путем поселения микроорганизмов на поверхности различных органов растений (эпифитное сообщество), но и путем внедрения их в ткани расте­ний (эндофитное сообщество). В результате сформировались как взаимополезные для растений и микроорганизмов симбиотические связи, так и неблагоприятные для растений антагони­стические связи, связанные с появлением фитопатогенов. Все микробиологические исследования ризосферы и филлосферы, начатые более полувека назад, связаны большей частью с при­кладными аспектами микробиологии. Это поиск микроорганиз­мов - стимуляторов роста сельскохозяйственных растений, раз­работка биологических основ борьбы с фитопатогенами, изуче­ние влияния почвенных условий на микробные сообщества и рост растений. В результате в качестве объектов исследования выбирались, главным образом, разнообразные культурные рас­тения.

Ход работы

ТЕМА 4

Оборудование и материалы

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Колбы, пенициллиновые флаконы.

5. Физиологический раствор.

6. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).

Общие сведения

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК В ВИРУСОЛОГИ

Значение культуры клеток и тканей в диагностических виру­сологических исследованиях. Внедрение метода культивирова­ния клеток и тканей в вирусологию и диагностику вирусных болезней позволило не только познать глубже сущность виру­сов, но и расшифровать этиологию ряда болезней, создать вы­сокоэффективные противовирусные вакцины (живые и убитые) для профилактики их. Открытие Дж. Эндерсом и сотрудника­ми способности вируса полиомиелита размножаться в культуре клеток (фибробласты эмбриона человека) послужило началом широкого применения этой системы в вирусологии, а открытие цитопатогенного действия вируса западного лошадиного энце­фаломиелита способствовало практическому использованию его в диагностике инфекции.

Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступления биологической смерти по­мещают их в соответствующие питательные среды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использо­ван массово.

Разработка метода дезагрегации тканей ферментативным путем, усовершенствование методов культивирования клеток и состава питательных сред создали основы для широкого при­менения культуры клеток в изучении общих и частных проблем вирусологии, и в частности разработки методов лабораторной диагностики вирусных болезней. Успехи техники культивирова­ния культуры клеток позволили наблюдать не только видимые изменения в инфицированных культурах, но и привели к от­крытию гемадсорбирующих вирусов.

В настоящее время число вирусов, выделяемых с помощью однослойных культур, резко уменьшилось по сравнению с ко­личеством вирусов, открытых сразу же после получения вируса полиомиелита. Оказалось, что некоторые вирусы трудно изо­лировать в однослойных культурах. В таких случаях требуются более изощренные лабораторные методы, максимально при­ближающие условия культивирования вируса к естественным, например использование культур органов. Однако одно­слойные культуры клеток не утратили своего значения.

Чрезвычайно важную роль во внедрении техники культуры ткани в широкую вирусологическую практику сыграло исполь­зование в питательных средах антибиотиков и антимикотических препаратов. Это позволило проводить исследования большого масштаба без чрезвычайно трудоемкой работы по предупреждению микробной контаминации культур. Другими важными усовершенствованиями техники тканевых культур явились употребление веществ, позволяющих диспергировать клетки и производить перевивку их взвесью, получение одно­слойных культур клеток и введение в практику синтетических культуралъных сред постоянного химического состава, сво­бодных от ингибиторов, действующих на вирус. Разработка и применение простых методов культивирования фрагментов органов и тканей для выделения и выращивания вирусов также внесли большой вклад в изучение этиологии и патогенеза ви­русных инфекций.

Культура тканей позволяет получить достаточно чистый вирус (с небольшим количеством чужеродных антигенов), что очень важно при изготовлении сывороток и антигенов для серо­логических реакций. С помощью серийных пассажей вирусов в культурах клеток удается получать аттенуированные (апатогенные) штаммы, пригодные для производства вакцин.

В настоящее время в практической вирусологии широко используются не только первично-трипсинизированные, но и перевиваемые, и диплоидные клетки.

Ход работы

Метод теплой трипсинизации используют для дисперги­рования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 — 5 мм, ткань многократно (3—4 раза) промывают физиологического раствора до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добавляют 0,25%-ный раствор трипсина, в которой перемешивают ткань 10 — 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают, а к ткани добавляют, свежую порцию 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 1:10-20. Температура раствора может варьировать от комнатной до 37°С.. Дезагрегацию ткани ферментом повторяют 2-3 раза;

в) последнюю экстракцию сливают в пенициллиновый флакон, клетки осаждают в течение 10-15мин;

г) осадок клеток собирают (с помощью пипетки) со дна флакона стараясь не захватывать крупные агрегаты ткани и определяют концентрацию клеток в суспензии.

Значительно реже для дезагрегации клеток используют ме­ханический способ.

Определение концентрации клеток. Для приготовления по­севной концентрации клеток необходимо вначале определить их концентрацию в исходной суспензии. Подсчет клеток про­изводят в счетных камерах различных систем (Горяева, Спенсе­ра, Бюркера, Тома, Фукс-Розенталя и др.). Для подсчета отби­рают пробу после тщательного перемешивания суспензии клеток. Для дифференциации живых и мертвых клеток исполь­зуют витальные красители: метиленовую синь или нейт­ральный красный. Подсчитывают количество живых клеток в 3 — 4 камерах (увеличение микроскопа: окуляр 7, объектив 20 по всей площади камеры, четырехкратно, каждый раз, заряжая камеру вновь, причем, во внимание берутся только те клетки, которые расположены в камере, в границах, очерченных сеткой – 225 больших квадратов), определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию клеток в 1 мл по формуле, соответствующей дан­ной системе камеры, например для камеры Горяева:

где 100- количество кубических миллиметров в 1 cм; а - количество клеток в камере; н - разведение клеточной суспензия; 0,9 - объем камеры Горяева в мм³

При использовании счетных камер других их систем в лааной формуле необходимо заменить знаменатель - объем камеры.

ТЕМА 5

Общие сведения

Вводные пояснения. Аммонификация — это минерализация азотсодержащих органических веществ, протекающая под воздействием аммонифицирующих микробов. Микроорганизмы, осуществляющие аммонификацию бел­ковых веществ, выделяют в окружающую среду протеолитические ферменты (протеазы и пептидазы), под действием кото­рых белки гидролизуются до аминокислот. В свою очередь, аминокислоты, поступая в клетку, дезаминируются с образова­нием аммиака (NH₃), органических кислот и других продук­тов. В белках С : N = 3,5 : 1. При разложении белков в анаэробных условиях выделяются также H₂S, меркаптаны, скатол и индол, имеющие неприятный запах, кадаверин и путресцин (диамины). В аэробных условиях конечными про­дуктами являются NH₃, CO₂, Н₂О, сульфаты.

Благодаря аммонификации представителей растительного и животного мира и их продуктов жизнедеятельности (мочевины, испражнений) почва обогащается азотом и другими соединениями. Одновременно с этим аммонифицирующие микробы выполняют огромную санитарную роль, очищая почву и гидросферу от разлагающегося органического субстрата. Основными представителями широко распространенных в природе аммонифицирующих микробов являются следующие микроорганизмы: Вас. probatus и Sporosarcina ureae.

Спорообразующие аэробы — это Вас. mesentericus (картофельная бактерия), Вас. megatherium (капустная бактерия), Вас. subtilis (сенная палочка), Вас. mycoides (грибовидная бацилла). Не образующие спор аэробные аммонификаторы — это Е. coli, Proteus vulgaris, Ps. fluorescens.

К анаэробным спорообразующим аммонификаторам относятся Cl. putrificum (газообразующая клостридия), Cl. sporogenes. Подсчитано, что весь животный мир земного шара за сутки выделяет 150 тыс. т мочевины. За год это составляет более 50 млн. т мочевины, или 20 млн. т азота.

Аммонификацию вызывают также актиномицеты, грибы, триходермы, живущие в почве.

Нитрификация — следующий за аммонификацией этап превращения азота микроорганизмами. Этот процесс представляет собой окисление аммиака, образующегося при разложении органических азотсодержащих соединений.

Денитрификация, протекающая под воздействием микробов, представляет собой восстановление нитратов с образованием в качестве конечного продукта — молекулярного азота, возвращающегося из почвы в атмосферу. Вызывается этот процесс денитрифицирующими бактериями. Наиболее распространенные из них в природе: Tiolacillus denitrificans — палочка, не образующая спор, факультативный анаэроб; Ps. fluorescens — подвижная палочка, выделяет зеленоватый пигмент, быстро разлагает нитраты; Ps. aeruginosa — бактерия сходна с предыдущей; Ps. Stutzeri — небольшая палочка, образующая цепочки, разлагает нитраты в анаэробных условиях.

Ход работы

ТЕМА 6

Оборудование и материалы

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Пробирки с жидкой питательной средой..

5. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).

Общие сведения

Широкая механизация сельского хо­зяйства приводит к загрязнению сельскохозяйственных земель значительным количеством углеводородов. Так, керосин и бензин, используемые в тракторных, автомобильных и дру­гих двигателях, мазут и дизельное топливо, применяемые на сельских электростанциях, попадая в почву, приводят к нару­шению ее свойств, ухудшают экологическую ситуацию, а ава­рийные разливы нефти превращают почву в техногенную пус­тыню. Образцы почвы, загрязненные нефтепродуктами, продемонстрировали мутагенные эффекты на растениях. В городе источниками загрязнения являются сети АЗС, моек, станций технического обслуживания автомобилей содержание нефтепродуктов в почвах "значительно увеличилось". Доля участков, загрязненных нефтепродуктами свыше допустимого уровня, в среднем по Москве составила 26%, бензофенолом - 34% от общего числа обследованных участков.

Состав нефти и нефтепродуктов характеризуется высо­ким процентом парафиновых, нафтеновых и ароматических углеводородов, В почве эти продукты окисляют микроорга­низмы. Углеводороды хорошо окисляют представители родов Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida), Mycobacterium, Arthrobacter и Nocardia. Загрязненные места должны быть рано или поздно подвергнуты очистке — ремедиации (ле­чению).Внесение в загрязненные почвы микроорганизмов, способных разлагать соответствующие специфические вещества используют в целях очистки загрязненных почв органическими веществами и нефтепродуктами. В настоящему времени выделено и описано большое количество бактерий, способных использовать нефтяные загрязнения, токсические соединения. Применение таких культур в качестве посевного материала может быть полезно в свежих загрязнениях, когда ав­тохтонная микробная популяция еще не успела развиться или плотность ее очень низка. В любом случае необходимо обеспечить доступность загрязняющих веществ для использования их микро­организмами. Здесь важную роль играют дисперсия и растворение загрязнителей, а также снабжение микроорганизмов источника­ми азота и фосфора. Их недостаток лимитирует микробный мета­болизм и рост, а это, в свою очередь, ограничивает процесс био­деградации.

Ход работы

Постановка опыта. В качестве единственного источника углерода добавляют 2 мл керосина или вазелинового масла в минимальную минеральную среду. Для заражения в пробирки помещают 1/3 чайной ложки почвы из пробы, отобран­ной у бензоколонки или у гаража. Пробирки помещают в термостат при 30 °С на 4—6 сут.

Исследование морфологии микроорганизмов.Для знакомства с микроорганиз­мами, окисляющими углеводороды, используют накопительную куль­туру из пробирок. Окрашивание производят по Граму. Окрашенный препарат микроскопируют, пользуясь объективами ´40 и ´90. Просматривая препараты, делают зарисовки микроорга