Метод окраски по Цилю-Нильсену.
1. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят карболовый фуксин Циля и нагревают до появления паров в течение 2-3 мин.
2. Бумагу удаляют пинцетом.
3. Препарат обесцвечивают 5% раствором Н2SО4 - 5 секунд.
4. Тщательно промывают водой.
5. Докрашивают метиленовым синим (Лёффлера) 2- 3 минуты.
6. Мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под иммерсией.
Микрокартина: клетки ткани и некислотоустойчивые бактерии – синие, микобактерии – красные.
Решающим дифференцирующим фактором в этом методе является воздействие на мазок серной кислоты, после чего некислотоустойчивые бактерии легко обесцвечиваются и воспринимают вторую окраску метиленовым синим.
Люминесцентная микроскопия
В микробиологии и вирусологии широкое применение нашла люминесцентная микроскопия, состоящая из двух методов: метода флуоресцирующих антител (МФА) и метода флуорохромирования (МФ).
Первый метод - МФА мы будем подробно изучать на вирусологии.
Второй МФ рассмотрим подробнее
Люминесцентная микроскопия - этот метод применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. Люминесценция (или флюоресценция) – это явление, когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны.
Различают собственную (первичную) и наведенную (вторичную) флюоресценцию. При первичной флюоресценции исследуемый объект содержит вещества, способные флюоресцировать при освещении их ультрафиолетовыми лучами. Большая часть объектов не обладает собственной флюоресценцией, поэтому при люминесцентной микроскопии их обрабатывают красителями (флюорохромами), способными флюоресцировать. Кроме того, вещества, имеющие определенный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретают совершенно другой цвет. Объект невидимый в ультрафиолетовом свете, может приобрести яркий блеск после обработки его флюорохромом. Флюорохромы связываются с нуклеиновыми кислотами или белками и образуют прочные комплексы, которые светятся в люминесцентном микроскопе желто-зеленным, оранжево-красным, коричнево-красным цветом. Сила их света бывает различной, но чаще всего она невелика, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в затемненном помещении. В качестве флюорохромов используют аурамин, акридин желтый, корифосфин, флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ).
Препарат для люминесцентной микроскопии готовят обычным способом, фиксируют в ацетоне или этаноле 5-10 мин и наносят на него флюорохром на 20-30 мин. После этого препарат промывают проточной водой 15-20 мин, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Установка для люминесцентной микроскопии в видимых лучах состоит из яркого источника света и биологического микроскопа.
В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два светофильтра: первый задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца, обработанного флюорохромом; второй пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.
Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями антител с антигенами изучаемого объекта. Антитела метят различными способами: флюорохромами (флюоресцеин, родамин и др.), при помощи ферментной реакции (пероксидаза хрена) или электронно-плотными частицами (ферретин, коллоидное золото).
МФ – основан на способности объекта светиться при пропускании через него пучка ультрафиолетовых (УФ) лучей.
В природе существует феномен аутолюминесценция, т.е. самосвечение в УФ лучах. Такой способностью обладают некоторые грибки. Однако для вирусов и патогенных бактерий это явление не свойственно, поэтому для окрашивания бактерий и телец-включений вирусов используют флуорохромные красители такие, как аурамин, родамин 6G, ФИТЦ (флуоресцеина изотиоцианат).
В результате повышается контрастность изображения и облегчается обнаружение на темном фоне препарата, светящихся возбудителей болезней.
Метод окраски по Бойюиспользуют длявыявления возбудителей Мyсobacterium в мазках из патматериала:
1) на фиксированный мазок через фильтровальную бумагу наносят флуорохромные красители: смесь аурамина с родамином (на 100 смз воды 0,1 г аурамина и 0,01 г родамина) нагревают мазок до появления паров в течение 3-4 минут;
2) бумагу удаляют пинцетом;
3) краску сливают;
4) препарат обесцвечивают в течение 10 -15 секунд 3% раствором хлористоводородного спирта (3 смз концентрированной хлористоводородной кислоты на 97 смз 70о спирта);
5) тщательно промывают водой.
6) обрабатывают 0,1% раствором КМnO4 в течение 20-30 секунд для гашения неспецифического свечения;
7) раствор сливают;
8) докрашивают 1% раствором метиленового синего;
9) мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и просматривают под люминесцентным микроскопом.
Микрокартина: на темном фоне мазка возбудители Мyсobacterium имеют оранжевое свечение, т.к. они не обесцвечиваются хлористоводородным спиртом, сопутствующая микрофлора обесцвечивается и теряет способность светиться в ультрафиолетовых лучах.