Приготовление фиксированных препаратов

Фиксированные (убитые) препараты используют для определения формы, взаимного расположения, особенностей цитологии клеток, для количественного учета микроорганизмов. Фиксированные препараты можно долго хранить, но их нельзя использовать для определения размеров микроорганизмов.

Приготовление фиксированных препаратов включает несколько этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксацию, окраску.

1. Приготовление мазка.

На предметное стекло поместить небольшую каплю суспензии микроорганизмов в воде и петлей распределить равномерным тонким слоем на площади 1-2 см². Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал почти сразу после приготовления.

2. Высушивание мазка.

Высушить мазок на воздухе.

3. Фиксация мазка. Цель фиксации - убить микроорганизмы, закрепить их на стекле, сделав клетки более восприимчивыми к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются легче, чем живые.

Самый распространенный способ фиксации - термический. Для этого препарат трижды проводят через верхнюю часть пламени горелки, держа предметное стекло пинцетом мазком вверх. Мазок не следует перегревать, так как это может привести к деформации клеток.

Более щадящей является фиксация различными химическими веществами (95% этанолом, безводным метанолом, парами формалина, 5% фосфорно-молибденовой кислотой, специально разработанными для определенных целей фиксаторами). Химическую фиксацию проводят, наливая на мазок фиксатор и выдерживая его определенное время.

4. Окраска мазка.

Различают простые и дифференциальные способы окраски. При простой окраске прокрашивается вся клетка, дифференциальная окраска позволяет выявить определенные структуры в клетке. Для простого окрашивания используют главным образом основные красители: метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, сафранин.

Фиксированный препарат поместить на стеклянные рейки над ванночкой. На фиксированный мазок нанести несколько капель красителя так, чтобы покрыть всю его поверхность. Краситель выдержать на мазке 3-5 минут, следя за тем, чтобы краситель не подсыхал на мазке. Затем краситель слить в кювету, препарат промыть водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.

5. Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.

6. Микроскопировать. В правильно приготовленном препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

4 Оформление результатов работы

1. Приготовить препарат исследуемой культуры "раздавленная капля" в воде и в красителе. Рассмотреть с иммерсионной системой, зарисовать.

2. Приготовить препарат исследуемой культуры "висячая капля". Рассмотреть с объективом 40х. Зарисовать.

3. Приготовить два фиксированных препарата, один из которых окрасить метиленовым синим, другой - основным фуксином. Зарисовать микроскопическую картину.

5 Контрольные вопросы

1. Как готовят предметные и покровные стекла к работе?

2. В каких случаях используют прижизненные препараты, а в каких - фиксированные?

3. Почему для окраски препаратов используют чаще всего основные красители?

4. Что такое тинкториальные свойства микроорганизма?

5. Какие методы используют для фиксации мазка на стекле?

6. Почему размеры клеток определяют с помощью прижизненных, а не фиксированных препаратов?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.

СТРОЕНИЕ ВЕГЕТАТИВНОГО ТЕЛА ГРИБОВ

Цель работы

Научиться выявлять характерные структуры вегетативного тела грибов.

Приборы и материалы

- Микроскоп,

- окулярная линейка,

- иммерсионное масло,

- фильтровальная бумага,

- жидкость для удаления иммерсионного масла,

- предметные и покровные стёкла,

- микробиологические петли и иглы,

- краситель метиленовый синий,

- чашки Петри со стерильной питательной средой.

Культуры: p.Mucor, p.Aspergillus, p.Penicillium, p.Candida, p. Saccharomyces.

Содержание работы

Вегетативное тело гриба называется таллом (от греч tallos – зелёная ветвь). У представителей царства грибов существуют следующие типы таллома: плазмодий, мицелий, псевдомицелий, одноклеточный (дрожжевидный).

Плазмодий - это амёбоидная масса с большим количеством ядер, не имеющая клеточной стенки. Таллом в виде плазмодия характерен для слизевиков и некоторых низших грибов. Для большинства и низших (Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes) и высших (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes) грибов характерен таллом в виде мицелия (грибницы). Мицелий – сложное переплетение гиф - тонких разветвленных трубочек (рисунок 5). Часто термины таллом и мицелий употребляются как синонимы. Одноклеточный таллом и псевдомицелийхарактерен для дрожжей (рисунок 6). Псевдомицелий морфологически похож на мицелий, но состоит из отдельных, не отделившихся друг от друга клеток (рисунок 6,7).

Типы гиф грибов

Гифа (от греч. hyphe – ткань) - это наиболее характерная морфологическая структура гриба, образующая мицелий. Нитевидной формой гифы всех грибов сходны между собой. Диаметр гиф варьирует у грибов от 2 до 170 мкм. В оболочке гифы заключена цитоплазма, непрерывно образующая новые клетки на конце гифы – апексе (от лат. apex – верхушка, маковка). Это участок длиной около 100 мкм. В нём различают 4 зоны (рисунок 8): максимальной кривизны, максимальной синтетической активности, зону растяжения, зону образования клеточной стенки. Растущие гифы разветвляются в зоне растяжения.

А – мицелий при малом увеличении (в 7 раз); б – мицелий при увеличении в 700 раз

Рисунок 5 – Мицелий грибов

А б

а – одноклеточный таллом; б - псевдомицелий

Рисунок 6 – Одноклеточный таллом и псевдомицелий

Рисунок 7 - Псевдомицелий

α – зона максимальной кривизны; β – зона максимальной синтетической активности; γ – зона растяжения; δ – зона образования регидной клеточной стенки.

Рисунок 8 - Строение апекса гифы (по /9/)

Гифы различаются по внутреннему строению и типу ветвления. По мере роста грибов от главной гифы образуются ответвления – боковые гифы. Типы ветвления гиф представлены на рисунке 9. Наиболее часто гифы грибов ветвятся нерегулярно.

По внутреннему строению гифы различаются наличием и расположением перегородок – септ (рисунок 10). Септы возникают в результате постепенного врастания внутрь гифы цитоплазматической мембраны и внутреннего слоя клеточной стенки. В большинстве случаев септы - это не полностью сросшиеся в центре образования (рисунок 10 Б,В). В их середине имеется пора, через которую происходит миграция цитоплазмы и ядер. Различают простые септы - простой диск с порой в центре, и долипоровые септы - ежегодно утолщающиеся вокруг края поры септы (рисунок 11, Г,Д). У некоторых грибов септы могут быть перфорированы большим количеством микропор. Перед отделением части гифы поры могут замыкаться с образованием перегородки.

Гифы низших грибов классов Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes не содержат регулярно расположенных септ и называются неклеточными, асептированными или ценоцитными (рисунок 10 А). Весь мицелий в этом случае представляет собой единственную многоядерную клетку. При старении, повреждениях в гифах низших грибов могут образовываться одиночные септы и перегородки. У более высоко развитых представителей низших грибов (класс Zygomycetes) есть тенденция к более регулярному септированию гиф.

1 2 3 4 5

1 – нерегулярное; 2 – моноподиальное; 3 – мутовчатое; 4 – дихотомическое;

5 – симподиальное

Рисунок 9 – Типы ветвления гиф грибов

а – несептированные; б,в – септированные

Рисунок 10 – Типы гиф грибов

А,Б,В – простые септы:

А – с порой (1); Б – с порой (1) и тельцем Воронина (2); В – с порой (1), закрытой оптически плотной цитоплазмой (3) и окружённой вакуолями (6);

Г,Д – долипоровые септы: 5 – поровый колпачок; 6 – долипора;

7 – эндоплазматический ретикулум.

Рисунок 11 – Типы септ грибов (по /8/)

Регулярно расположенные по длине гифы септы характерны для высших грибов классов Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes. Такие гифы называются септированными (рисунок 9 б,в).

Типы мицелия

Мицелий, образованный ценоцитными гифами, называется ценоцитным или несептированным. Соответственно, если мицелий образован септированными гифами, то он называется септированным.

Часть мицелия гриба обычно находится над поверхностью субстрата, часть – внутри него. На этом основании различают воздушный и субстратный мицелий. Гифы, образующие субстратный и воздушный мицелий, морфологически различны. Гифы воздушного мицелия более тонкие, ровные, разветвлённые, а субстратные - более толстые, неровные, слабо ветвящиеся, сильно вакуолизированные. Для грибов, паразитирующих на растениях, воздушный мицелий называют экзофитным, субстратный – эндофитным.