Методы изучения морфологии и цитологии микромицетов
Т.Б.Лисицкая
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ И ЦИТОЛОГИИ МИКРОМИЦЕТОВ
Методические указания
к лабораторным работам
Санкт-Петербург
УДК 576.8
Лисицкая Т.Б. Методы изучения морфологии и цитологии микромицетов: методические указания к лабораторным работам / Т.Б.Лисицкая.- СПб.: СПбГТИ(ТУ), 2012.- 69 с.
В методических указаниях представлены лабораторные работы по курсу «Общая биология и микробиология». В методических указаниях излагаются: методы работы с микроорганизмами, строение вегетативного тела грибов, цитология клетки грибов, способы их размножения.
Методические указания предназначены для бакалавров I курса, обучающихся по направлению 240700.62 «биотехнология» и соответствуют рабочей программе по дисциплине "Общая биология и микробиология". Процесс изучения дисциплины направлен на формирование следующих компетенций в соответствии с ФГОС ВПО по направлению «Биотехнология»:
– владеть культурой мышления, быть способным к обобщению, анализу, восприятию информации, постановке цели и выбору путей ее достижения (ОК-1);
– стремиться к саморазвитию, повышению своей квалификации и мастерства, приобретать новые знания в области техники и технологии, математики, естественных, гуманитарных, социальных и экономических наук (ОК-7);
– быть способным и готовым использовать основные законы естественнонаучных дисциплин в профессиональной деятельности (ПК-1);
– владеть основными методами и приемами проведения экспериментальных исследований в своей профессиональной области (ПК-7).
Рис.28 , табл.3 , библиогр. 12 назв.
Рецензент:
Д.О.Виноходов, д-р.биол.наук,
профессор кафедры молекулярной
биотехнологии СПбГТИ(ТУ)
Утверждено на заседании учебно-методической комиссии факультета химической и биотехнологии 04.04.2012
Рекомендовано к изданию РИСо СПбГТИ(ТУ)
ВВЕДЕНИЕ
Основными объектами в биотехнологии являются микроорганизмы, в основном относящиеся к царствам бактерий и грибов. В данном курсе объектом изучения являются микроскопические грибы – микромицеты. Малые размеры организмов диктуют специальные правила и методы работы с ними.
Целью лабораторных работ является овладение навыками работы с микромицетами: способами изучения их строения, правилами работы с соблюдением условий стерильности, методами выращивания. В результате студенты будут знать правила микроскопирования, способы приготовления различных видов препаратов, морфологию одно- и многоклеточных грибов, строение клетки грибов, способы размножения грибов.
ПРАВИЛА РАБОТЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1.
ПРАВИЛА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
1 Цель работы
Изучить устройство светопольного микроскопа и усвоить правила микроскопирования препаратов.
2 Приборы и материалы
- Светопольный микроскоп,
- иммерсионное масло,
- фильтровальная бумага,
- салфетка,
- жидкость для удаления иммерсионного масла,
- три готовых фиксированных препарата микроорганизмов.
Содержание работы
Для обнаружения, наблюдения и изучения организмов, размеры которых не превышают 1 мм, используют специальные оптические приборы – микроскопы (от греч. micros - малый, scopeo - смотрю).
По классу сложности микроскопы делятся на учебные, рабочие, лабораторные, исследовательские. По типу освещения микроскопы бывают: светопольные, темнопольные, поляризационные, люминесцентные, фазово-контрастные, электронные. Светопольные микроскопы позволяют исследовать малые объекты в проходящем свете (светлое поле).
Рисунок 1 – Устройство светопольного микроскопа
Тубус микроскопа (8) – узел, служащий для установки объективов и окуляров на определённом расстоянии друг от друга. Он представляет собой трубку длиной 16 см, в верхнюю часть которой вставляется окуляр или бинокулярная насадка, а в нижней находится устройство для крепления и смены объективов – револьвер (9) с несколькими гнёздами для быстрой смены объективов различного увеличения. В каждом гнезде револьвера объектив закреплён таким образом, что он всегда центрирован по отношению к оптической оси микроскопа (положение «на щелчке»). В наклонном тубусе между объективом и окуляром располагаются призмы для изменения хода лучей. В прямом тубусе призмы отсутствуют.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объективов (13) и окуляра (14) (одного или двух).
Осветительный аппарат светопольного микроскопа расположен под предметным столиком и состоит из осветителя и конденсора (12).
В качестве источника света в осветителях микроскопов обычно используют низковольтные лампы накаливания (1,5 В) с толстой нитью. Осветители бывают в виде отдельного выносного устройства, накладные или встроенные в подошву микроскопа.
Для работы с выносным осветителем в штатив микроскопа под конденсором вставляется зеркало (15). Зеркало направляет световые лучи от осветителя на препарат. Зеркало имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. Вогнутое зеркало собирает пучок лучей, идущих от источника света, и концентрирует его в плоскости препарата. Вогнутым зеркалом можно пользоваться только в тех случаях, когда работают без конденсора (при малых увеличениях). При работе с конденсором пользуются только плоским зеркалом. Плоское зеркало можно заменить встроенным в подошву микроскопа или накладным осветителем.
Конденсор (12) служит для собирания параллельных лучей света от осветителя в плоскости препарата (фокусе). Конденсор вставляют в кронштейн (6) и закрепляют в нём специальным металлическим винтом (16). Конденсор состоит из системы светособирающих линз, ирисовой (апертурной) диафрагмы и оправы для светофильтра. При опускании конденсора винтом (7) поле зрения затемняется, при поднимании - освещается.
Ирисовая (апертурная) диафрагма (17), вмонтированная в нижнюю часть конденсора, состоит из тонких металлических сегментов, которые при помощи рычажка (18) можно сдвигать или раздвигать, регулируя этим поступление света в конденсор (апертуру).
Под ирисовой диафрагмой конденсора находится откидная оправа для светофильтра (на рисунке не показана). Светофильтры делят на два типа: ослабляющие световой поток без изменения спектрального состава света (например, матовое стекло) и выделяющие какую-либо область спектра, что позволяет освещать препарат светом с определённой длиной волны.
Объективы (13) микроскопа служат для увеличения объекта. Они ввинчиваются в гнезда револьвера (9) и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Объектив дает действительное, увеличенное и перевёрнутое изображение изучаемого объекта.
Единственной линзой, от которой зависит увеличение объектива, является наружная или фронтальная линза. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и больше увеличение объектива. Увеличение объектива указано на его оправе (8х, 10х, 20х, 40х, 60х, 90х).
Остальные линзы объектива, расположенные выше фронтальной, только исправляют недостатки полученного изображения (аберрации) и называются коррекционными линзами. Наиболее существенные аберрации - сферическая и хроматическая. Сферическая аберрация проявляется в невозможности одновременной фокусировки всего поля зрения. Хроматическая аберрация связана с разложением белого света в спектр, из-за чего изображение приобретает радужную окраску. Объективы, у которых сферическая и хроматическая аберрации скоррегированы не полностью, называются ахроматическими объективами (ахроматы). Они содержат до шести коррекционных линз и дают изображение наиболее чёткое в центре, а края поля зрения видны плохо и бывают окрашены в разные цвета спектра. Ахроматические объективы широко распространены из-за своей простоты и дешевизны.
Более совершенные объективы называются апохроматическими (апохроматами). На их оправе имеется обозначение "АПО". Они имеют 10-12 коррекционных линз, значительно снижающих оба вида аберраций.
Полностью устраняют искривление поля зрения плоские планахроматические объективы - планахроматы (на оправе обозначение "ПЛАН").
Объективы делятся на сухие и иммерсионные (от лат. immersio - погружать). Сухими называются объективы, при работе с которыми между фронтальной линзой и объектом находится воздух. Объективы, которые дают увеличение в 8, 10, 20, 40 раз являются сухими. Иммерсионными называются объективы, фронтальная линза которых погружается в нанесенную на препарат каплю жидкости с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла (рисунок 2). Лучшим для этой цели является иммерсионное масло с коэффициентом преломления n = 1,515 (для сравнения, коэффициент преломления стекла составляет 1,52). Световые лучи при переходе из стекла в слой масла не преломляются и попадают в объектив. Для иммерсии используют также воду (n = 1,33). Иммерсионные объективы имеют соответствующие обозначения на оправе: масляная иммерсия - "МИ" и черное кольцо (90х, 60х); водная иммерсия - "ВИ" и белое кольцо (60х).
 |
Рисунок 2 – Ход лучей в сухой и иммерсионной системе микроскопа
Полученное промежуточное изображение, даваемое объективом, рассматривают через окуляр. Окуляр (14) (от лат. oculus - глаз) вставляется в верхний конец тубуса (7). Окуляр состоит из двух линз: верхней (глазная линза) и нижней (собирающая линза) - и исполняет роль лупы, увеличивая изображение, даваемое объективами до величины, хорошо различимой глазом. Изображение, даваемое окуляром, можно проецировать на фото-, киноплёнку или мишень видеокамеры. Окуляры могут увеличивать в 5х, 7х, 10х, 12х, 15х и 20х раз, что указано на их оправе. Между линзами окуляра в фокусе глазной линзы имеется диафрагма, ограничивающая поле зрения и задерживающая краевые лучи света.
При работе с ахроматами больших увеличений и апохроматами применяют более сложные компенсаторные окуляры, устраняющие оптические недостатки (аберрации) объективов. На их оправе имеется обозначение «К» или «Комп».
По количеству окуляров микроскопы бывают монокулярные, бинокулярые и тринокулярные. Монокулярные служат для наблюдения одним глазом, бинокулярные – для одновременного наблюдения двумя глазами, трунокулярные имеют два окуляра и проекционный выход, позволяющий одновременно с визуальным наблюдением двумя глазами проецировать изображение препарата соответствующей оптикой на фото-, киноплёнку, телевизионную камеру.
Правила микроскопирования
1. Конденсор поднять вверх до упора так, чтобы верхняя линза конденсора находилась на уровне предметного столика. Проверить положение откидной оправы светофильтра. Для смягчения освещенности поля зрения в оправу можно поместить матовое стекло или синий светофильтр.
2. Поместить препарат на предметный столик и укрепить его клеммами.
3. Микроскопирование начать с обзорного просмотра препарата при малом увеличении. Объектив 8х установить на оптической оси, вращая револьвер до щелчка, и опустить с помощью макрометрического винта на расстояние около 0,5 см от препарата. Привести в соответствие апертуру конденсора с апертурой используемого объектива, регулируя световой поток диафрагмой конденсора (рисунок 4).
4. Глядя в окуляр и медленно вращая макрометрический винт на себя, сфокусировать изображение препарата. Медленно передвигая препарат на предметном столике, найти подходящее для микроскопирования поле зрения - участок препарата, на котором микроорганизмы находятся в достаточном для просмотра количестве и располагаются равномерно в один слой.
5. Аналогично провести работу с объективом 40х. Объектив установить на оптической оси с помощью револьвера и опустить его почти до соприкосновения с препаратом (рисунок 4). Глядя в окуляр, медленно поднять тубус макрометрическим винтом до появления отчетливого изображения препарата.
6. Поднять тубус макрометрическим винтом, и на оптической оси установить объектив 90х. Полностью открыть диафрагму конденсора. На выбранный участок препарата нанести каплю иммерсионного масла. При визуальном наблюдении сбоку опустить тубус поворотом макрометрического винта до соприкосновения фронтальной линзы объектива с каплей масла и слегка раздавить ее. Необходимо следить за тем, чтобы не испортить линзу объектива и не раздавить предметное стекло! Глядя в окуляр, очень медленно поднять тубус макрометрическим винтом до появления контуров изображения. Точную фокусировку произвести микрометрическим винтом. Микрометрическим винтом пользуются только для тонкой окончательной фокусировки препарата, вращая его не более, чем на один полный оборот!
7. Зарисовать микроскопическую картину.
8. По окончании микроскопирования поднять тубус вращением макрометрического винта и убрать препарат с предметного столика. Запрещается вытаскивать препарат из-под опущенного объектива!
9. С фронтальной линзы иммерсионного объектива осторожно стереть масло сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем салфеткой, слегка смоченной жидкостью, предназначенной для удаления масла. Оставленное на объективе масло портит оптику микроскопа!
10. С препарата иммерсионное масло стереть фильтровальной бумагой.
4 Оформление результатов работы
1. Ознакомиться с устройством светопольного микроскопа.
2. Записать правила микроскопирования в рабочий журнал.
3. Просмотреть демонстрационные фиксированные препараты микроорганизмов, последовательно используя объективы 8х, 40х, 90х. Сделать зарисовки препаратов в рабочем журнале.
5 Контрольные вопросы
1. Что входит в состав механической части микроскопа?
2. Каково назначение элементов, входящих в состав оптической части микроскопа?
3. Какой тип объективов дает наилучшее качество изображения?
4. Чем отличаются иммерсионные объективы от сухих?
5. Какие характеристики объективов и окуляров указаны на их оправах?
6. Что означает понятие "разрешающая способность" микроскопа? Как можно ее увеличить?
7. Определите числовую апертуру объективов 8х, 40х, 90х, пользуясь рисунком 3.
8. Каковы правила микроскопирования препаратов с иммерсионным объективом?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2.
Приборы и материалы
- Бактериологическая петля,
- бактериологическая игла,
- стерильная пипетка,
- спиртовка;
- два косяка СПА (сухой питательный агар);
- колба со средой СПА;
- две пробирки с жидкой питательной средой,
- одна пробирка с водой;
- три чашки Петри;
- культура микроорганизма на скошенном агаре.
Содержание работы
Порядок выполнения работы
1. Заранее простерилизовать пипетки в бумажной обертке, пакетах или металлических пеналах. Вата, вложенная в верхний конец пипетки, предохраняет от попадания в пипетку посторонних микроорганизмов, а также защищает работающего от попадания микроорганизмов в рот.
2. Зажечь горелку.
3. Вынуть пипетку за верхний конец из бумаги или пенала. Держать пипетку нужно большим и средним пальцем, зажав верхнее отверстие указательным пальцем. Не касаться кончиком пипетки руки и окружающих предметов!
4. Взять пробирку с культурой в другую руку за нижнюю часть.
5. Вынуть пробку из пробирки, зажав пробку мизинцем и ладонью той руки, в которой находится пипетка.
6. Обжечь края пробирки в пламени спиртовки.
7. Ввести пипетку в пробирку, сняв указательный палец с верхнего отверстия пипетки. Если жидкости, вошедшей при этом в пипетку, недостаточно, то можно осторожно затянуть ее ртом.
8. Закрыв указательным пальцем верхнее отверстие пипетки, вынуть ее из пробирки, стараясь не касаться концом пипетки стенок и края пробирки.
9. Обжечь край пробирки и конец пробки в пламени, закрыть пробирку пробкой.
10. Использовать взятый пипеткой материал для посева или приготовления препарата.
11. Пипетку с остатками микроорганизмов немедленно поставить в стакан с дезинфицирующим раствором.
Посев микроорганизмов
Культура микроорганизмов, отобранная петлёй с поверхности агаризованной среды или пипеткой из жидкой среды, может служить посевным материалом для засева агаризованной или жидкой питательной среды.
Оформление результатов работы
1. Произвести посев культуры, выращенной на скошенной агаризованной среде в пробирке, петлёй:
а) в пробирку на скошенный питательный агар;
б) в пробирку с жидкой средой;
в) на чашку Петри.
2. Посеять культуру, выращенную в жидкой среде, с помощью петли:
а) в пробирку с жидкой средой;
б) в пробирку на скошенный агар;
в) на чашку Петри.
3. Посеять культуру, выращенную в жидкой среде, с помощью пипетки:
а) в пробирку с жидкой средой;
б) на чашку Петри.
5 Контрольные вопросы
1. Какие инструменты используют при посевах микроорганизмов и при приготовлении препаратов?
2. Как стерилизуют петлю (иглу)?
3. В каких случаях используется стерильная пипетка?
4. Чем обусловлены правила работы с чистыми культурами микроорганизмов?
5. Сравните порядок работы при отборе культуры с различных сред и посеве микроорганизмов. Какие этапы являются общими для всех операций?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3.
Приборы и материалы
- Микроскоп
- Предметные и покровные стекла,
- стекла с лункой,
- метиленовый синий (1: 10),
- основной фуксин,
- вазелин,
- смесь спирта и эфира (1:1).
Культуры дрожжей: p.Candida, p. Saccharomyces.
Содержание работы
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.
Цель работы
Научиться выявлять характерные структуры вегетативного тела грибов.
Приборы и материалы
- Микроскоп,
- окулярная линейка,
- иммерсионное масло,
- фильтровальная бумага,
- жидкость для удаления иммерсионного масла,
- предметные и покровные стёкла,
- микробиологические петли и иглы,
- краситель метиленовый синий,
- чашки Петри со стерильной питательной средой.
Культуры: p.Mucor, p.Aspergillus, p.Penicillium, p.Candida, p. Saccharomyces.
Содержание работы
Вегетативное тело гриба называется таллом (от греч tallos – зелёная ветвь). У представителей царства грибов существуют следующие типы таллома: плазмодий, мицелий, псевдомицелий, одноклеточный (дрожжевидный).
Плазмодий - это амёбоидная масса с большим количеством ядер, не имеющая клеточной стенки. Таллом в виде плазмодия характерен для слизевиков и некоторых низших грибов. Для большинства и низших (Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes) и высших (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes) грибов характерен таллом в виде мицелия (грибницы). Мицелий – сложное переплетение гиф - тонких разветвленных трубочек (рисунок 5). Часто термины таллом и мицелий употребляются как синонимы. Одноклеточный таллом и псевдомицелийхарактерен для дрожжей (рисунок 6). Псевдомицелий морфологически похож на мицелий, но состоит из отдельных, не отделившихся друг от друга клеток (рисунок 6,7).
Типы гиф грибов
Гифа (от греч. hyphe – ткань) - это наиболее характерная морфологическая структура гриба, образующая мицелий. Нитевидной формой гифы всех грибов сходны между собой. Диаметр гиф варьирует у грибов от 2 до 170 мкм. В оболочке гифы заключена цитоплазма, непрерывно образующая новые клетки на конце гифы – апексе (от лат. apex – верхушка, маковка). Это участок длиной около 100 мкм. В нём различают 4 зоны (рисунок 8): максимальной кривизны, максимальной синтетической активности, зону растяжения, зону образования клеточной стенки. Растущие гифы разветвляются в зоне растяжения.
А – мицелий при малом увеличении (в 7 раз); б – мицелий при увеличении в 700 раз
Рисунок 5 – Мицелий грибов
А б
а – одноклеточный таллом; б - псевдомицелий
Рисунок 6 – Одноклеточный таллом и псевдомицелий
Рисунок 7 - Псевдомицелий
α – зона максимальной кривизны; β – зона максимальной синтетической активности; γ – зона растяжения; δ – зона образования регидной клеточной стенки.
Рисунок 8 - Строение апекса гифы (по /9/)
Гифы различаются по внутреннему строению и типу ветвления. По мере роста грибов от главной гифы образуются ответвления – боковые гифы. Типы ветвления гиф представлены на рисунке 9. Наиболее часто гифы грибов ветвятся нерегулярно.
По внутреннему строению гифы различаются наличием и расположением перегородок – септ (рисунок 10). Септы возникают в результате постепенного врастания внутрь гифы цитоплазматической мембраны и внутреннего слоя клеточной стенки. В большинстве случаев септы - это не полностью сросшиеся в центре образования (рисунок 10 Б,В). В их середине имеется пора, через которую происходит миграция цитоплазмы и ядер. Различают простые септы - простой диск с порой в центре, и долипоровые септы - ежегодно утолщающиеся вокруг края поры септы (рисунок 11, Г,Д). У некоторых грибов септы могут быть перфорированы большим количеством микропор. Перед отделением части гифы поры могут замыкаться с образованием перегородки.
Гифы низших грибов классов Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes не содержат регулярно расположенных септ и называются неклеточными, асептированными или ценоцитными (рисунок 10 А). Весь мицелий в этом случае представляет собой единственную многоядерную клетку. При старении, повреждениях в гифах низших грибов могут образовываться одиночные септы и перегородки. У более высоко развитых представителей низших грибов (класс Zygomycetes) есть тенденция к более регулярному септированию гиф.
1 2 3 4 5
1 – нерегулярное; 2 – моноподиальное; 3 – мутовчатое; 4 – дихотомическое;
5 – симподиальное
Рисунок 9 – Типы ветвления гиф грибов
а – несептированные; б,в – септированные
Рисунок 10 – Типы гиф грибов
А,Б,В – простые септы:
А – с порой (1); Б – с порой (1) и тельцем Воронина (2); В – с порой (1), закрытой оптически плотной цитоплазмой (3) и окружённой вакуолями (6);
Г,Д – долипоровые септы: 5 – поровый колпачок; 6 – долипора;
7 – эндоплазматический ретикулум.
Рисунок 11 – Типы септ грибов (по /8/)
Регулярно расположенные по длине гифы септы характерны для высших грибов классов Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes. Такие гифы называются септированными (рисунок 9 б,в).
Типы мицелия
Мицелий, образованный ценоцитными гифами, называется ценоцитным или несептированным. Соответственно, если мицелий образован септированными гифами, то он называется септированным.
Часть мицелия гриба обычно находится над поверхностью субстрата, часть – внутри него. На этом основании различают воздушный и субстратный мицелий. Гифы, образующие субстратный и воздушный мицелий, морфологически различны. Гифы воздушного мицелия более тонкие, ровные, разветвлённые, а субстратные - более толстые, неровные, слабо ветвящиеся, сильно вакуолизированные. Для грибов, паразитирующих на растениях, воздушный мицелий называют экзофитным, субстратный – эндофитным.
Рисунок 12 – Формы дрожжей
Оформление результатов работы
1. Приготовить прижизненные препараты и определить тип таллома грибов родов Aspergillus, Saccharomyces, Candida.
2. Рассмотреть на чашках Петри и описать морфологические признаки колоний грибов разных классов, определяемые без микроскопа. Результаты представить в виде таблицы 1.
3. Рассмотреть под микроскопом (объектив 8х) край колонии грибов на чашках Петри, определить тип ветвления гиф грибов, угол между главной и боковыми гифами грибов. Результаты внести в таблицу 1.
5 Контрольные вопросы
1. Какие типы таллома встречаются у грибов?
2. Какие типы таллома встречаются чаще других?
3. Что такое мицелий?
4. Грибы каких классов имеют септированный мицелий?
5. Как устроены септы грибов?
6. Назовите типы ветвления гиф мицелия.
7. Чем отличается воздушный мицелий от субстратного?
8. Что такое эндофитный мицелий?
9. Как устроен апекс гифы?
10. Какую форму имеют клетки дрожжей?
11. От чего зависит форма дрожжей?
Таблица 1 – Морфология колоний грибов
| Признак | Культуры грибов | |||||
| Форма колонии | ||||||
| Диаметр колонии, мм | ||||||
| Диаметр центра колонии, мм | ||||||
| Ширина края колонии, мм | ||||||
| Поверхность колонии | ||||||
| Цвет вегетативного мицелия | ||||||
| Цвет репродуктивных органов | ||||||
| Цвет обратной стороны колонии (инверсума) | ||||||
| Наличие и цвет капель жидкости на поверхности колонии (эксудата) | ||||||
| Выделение пигмента | ||||||
| Наличие септ | ||||||
| Тип септирования | ||||||
| Расстояние между септами, мкм | ||||||
| Диаметр гиф у края колонии, мкм | ||||||
| Диаметр гиф в центре колонии, мкм | ||||||
| Тип ветвления гиф | ||||||
| Угол ветвления боковых гиф | ||||||
| Наличие воздушного мицелия | ||||||
| Наличие видоизменений мицелия |
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5.
Цель работы
Научиться выявлять отдельные компоненты клетки грибов методами дифференциального окрашивания.
Приборы и материалы
Микроскоп,
иммерсионное масло,
фильтровальная бумага,
жидкость для удаления иммерсионного масла,
предметные и покровные стёкла,
микробиологические петли и иглы,
пинцеты.
Для окраски клеточной стенки:
20% водный раствор таннина,
Для окраски запасных питательных веществ:
- раствор Люголя,
- судан III,
- 40% формалин,
- метиленовый синий (1:40),
- метиленовый синий по Лёффлеру,
- фуксин Циля,
- 1% серная кислота.
Для окраски ядер:
- акридиновый оранжевый (1:5000),
- нейтральный красный.
Культуры: p.Chaetomium, p.Aspergillus, p.Candida, p. Saccharomyces.
Содержание работы
Строение клетки грибов
Клетка грибов – это эукариотическая клетка. У высших мицелиальных грибов клетка – это часть гифы от одной септы до другой. У низших грибов клеткой является всё тело. Одноклеточными грибами являются дрожжи. В любом случае клетка грибов состоит из цитоплазмы с пронизывающей её эндоплазматической сетью (ЭС), окружена цитоплазматической мембраной (ЦПМ) и клеточной стенкой, которая есть не у всех грибов. Строение и функции большинства клеточных структур микромицетов (ЦПМ, ЭС, аппарата Гольджи, ядра, митохондрий, рибосом) являются типичными для эукариотической клетки (рисунок 13).
1 – клеточная стенка; 2 – цитоплазматическая мембрана; 3 – хитосома; 4 – ядро; 5 – ядерная пора; 6 – жировая капля;
7 – элементы эндоплазматической сети; 8 – митохондрия; 9 – элементы аппарата Гольджи; 10 – вакуоль; 11 – гранулы полифосфатов
Рисунок 13 – Строение клетки грибов
Ядро клетки у грибов обычно малых размеров 2-3 мкм в диаметре, но есть ядра до 80 мкм. По форме ядра чаще округлые или вытянутые. У низших грибов клетки многоядерные (более 100 ядер) – мультикарионы. У аскомицетов и дейтеромицетов клетки обычно одноядерны – монокарионы. Клетки базидиомицетов содержат по 2 синхронно делящихся ядра – дикарионы. Для грибов характерна миграция ядер, которая происходит обычно из старых частей мицелия в более молодые. В результате мультикарионы могут встречаться и у высших грибов. Обычно в ядре грибов содержится 8 линейных хромосом, но число их у разных грибов может быть от 3 до 28. Ядерная мембрана двухслойная, связана с ЭС.
Ядрышко – у большинства грибов различимо в интерфазе, при митозе не выявляется. У некоторых зигомицетов оно сохраняется при митозе. Иногда (у некоторых хитридиомицетов, базидиомицетов и дрожжей) образовавшееся в телофазе митоза ядрышко выталкивается в цитоплазму перед окончательным делением ядра. У некоторых грибов ядрышка нет, в зооспорах вместо него присутствует ядерный колпачок, по компонентному составу на 50-70% состоящий из РНК, 30-50% белка, небольшого количества ДНК или представляет собой скопление почти зрелых рибосом.
Клеточный центр у грибов располагается у ядра, часто даже в углублении ядерной мембраны. В клеточном центре центриоли есть не у всех грибов, их нет у некоторых низших грибов и дрожжей.
Вакуоли характерны для грибов так же, как и для растений. Особенно крупные вакуоли, занимающие до 90% объёма клетки, наблюдаются в старой части мицелия, молодые гифы слабо вакуолизированны. В апексе гиф вакуолей нет. В вакуолях, происходящих от ЭС, содержатся запасные питательные вещества, а в вакуолях, образующихся от аппарата Гольджи, находятся выделяемые клеткой вещества.
В качестве резервного источника углерода у грибов обнаружены гликогеноподобные полисахариды и липиды. Гранулы и капли этих запасных веществ откладываются и в цитоплазме, и в вакуолях грибной клетки.
Гранулы полифосфатов (метахроматина) можно обнаружить по всей цитоплазме. Это запас фосфорной кислоты в клетке.
Клеточная стенка есть у большинства грибов. Она выполняет ряд важных функций:
- определяет форму клетки;
- защищает протопласт от механических воздействий;
- осуществляет контакт клетки со средой и другими организмами;
- является местом локализации некоторых ферментов;
- у некоторых грибов участвует в образовании и распространении спор;
- обладает антигенными свойствами.
В последние годы особое значение придаётся химическому составу клеточной стенки. Он зависит от многих факторов, например, меняется при переходе из дрожжевой в мицелиальную стадию роста.
Основу клеточной стенки (80-90%) составляют полисахариды. Минорные компоненты – моносахариды, белки, липиды, полифосфаты, пигменты, кристаллы солей. Содержание пигментов (меланина) может быть очень высоким – до 18% от веса стенки.
Клеточная стенка многослойна (рисунок 14). Наружный слой обычно образован неплотно расположенными молекулами полисахаридов, внутренние слои (их может быть несколько) – плотно и регулярно уложенными полисахаридами. Иногда аморфный слой из неплотно упакованных полисахаридов виден и с внутренней стороны клеточной стенки. Наружный слой клеточной стенки состоит из глюканов. Состав внутренних слоёв различен у разных классов грибов. У большинства грибов внутренние слои состоят из хитин-глюканового комплекса; у зигомицетов – из хитин-хитозанового, у оомицетов – из целлюлозо-глюканового комплекса.
Особый состав характерен для клеточной стенки дрожжей. Это маннано-глюкановый комплекс, из маннана состоит наружный слой стенки, внутренний – из глюкана. Небольшое количество хитина обнаруживают в клеточной стенке дрожжей в местах отделения почки – почечном рубце.
Полисахариды клеточной стенки образуются в ЭС и с помощью мелких вакуолей, отшнуровывающихся от аппарата Гольджи, транспортируются к ЦПМ. Пузырьки, содержащие хитин, называют хитосомами (рисунок 13, 3). Хитосом особенно много в апикальной части гиф, где идёт активное строительство клеточной стенки.
На поверхности клеточной стенки некоторых спор грибов образуются шипы, бородавки, складки. Клеточная стенка многих грибных спор гидрофобна.
Над поверхностью клеточной стенки у дрожжей часто бывает капсула, состоящая из полисахаридов. Состав капсулы видоспецифичен (β-маннаны, фосфоманнаны, гетерополисахариды). Полисахариды капсулы постоянно отделяются и уходят в среду – внеклеточные полисахариды.
Жгутики - органы движения зооспор, планогамет и планозигот низших грибов и слизевиков. У высших грибов подвижных стадий в жизненном цикле нет. Тонкое строение жгутиков грибов типично для эукариотической клетки. Жгутик образован двадцатью микротрубочками, покрытых ЦПМ, при чём девять пар микротрубочек расположены по
окружности, а одна пара – в центре аксонемы жгутика. Формула системы микротрубочек жгутика: 9х2+2.
Жгутики бывают двух типов: гладкий и перистый. По строению они одинаковы, только на перистом жгутике имеются белковые выросты не фибриллярной природы. Хитридиомицеты имеют один гладкий жгутик, оомицеты – два (гладкий и перистый), миксомицеты – два гладких (рисунок 15). Место прикрепления жгутика к клетке может быть разным: спереди – апикально, сбоку – латерально, сзади – терминально.
Тип, число и место прикрепления жгутиков используется для классификации низших грибов.
Для выявления отдельных структур в клетках всех микроорганизмов, в том числе и эукариотических, используют дифференциальные методы окрашивания. Дифференциальные методы окрашивания основаны на способности красителей связываться только с определёнными клеточными компонентами. В отличие от простых методов окрашивания, дифференциальные методы, как правило, более сложны методически.
1 – наружный слой полисахаридов; 2-6 – внутренние слои полисахаридов; 7 – цитоплазматическая мембрана; 8 – септа; 9 – пора септы
Рисунок 14 – Схематическое строение клеточной стенки грибов
| |
| |
| |