Методы культивирования продуцентов антибиотиков

Введение

После установления высоких лечебных свойств первого антибио­тика - пенициллина сразу же возникли задачи организации его произ­водства в больших количествах. На первом этапе промышленное полу­чение этого препарата носило примитивный, экономически нерента­бельный характер. Выращивание продуцента антибиотика осуществля­лось на средах, находящихся в небольших сосудах, при поверхностном культивировании гриба. Процесс развития гриба продолжался 8-10 су­ток. Такой способ культивирования гриба при большой затрате труда да­вал весьма низкий выход антибиотика, и себестоимость препарата была соответственно очень высокой. В результате поисков путей наиболее ра­ционального способа производства антибиотика был предложен метод глубинного выращивания гриба в специальных емкостях- ферментаторах при продувании воздуха и перемешивании культураль­ной жидкости.

Современное промышленное получение антибиотиков - это сложная многоступенчатая биотехнологическая схема, состоящая из ря­да последовательных стадий:

1. Стадии биосинтеза (образования) антибиотика.

Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии - создание оптимальных усло­вий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.

Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма, в том числе стоимости применяемых предшественников, а также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием продуцента антибиотического вещества.

2. Стадии предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделение культу- ральной жидкости от биомассы продуцента).

Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно).

3. Стадия и выделения и очистки антибиотика.

На этой стадии, в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества, применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются экстрация, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка.

Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первой стадии работы имеют дело с небольшой концентрацией (~1 %) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах его концентрация увеличивается до 20-30 %. Все это требует применения различных емкостей и объемов используемых реагентов.

4. Стадии получения готовой продукции, изготовления лекар­ственных форм, расфасовки.

Особенность стадии определяется очень высоким требованиям к качеству конечного продукта. В случае выпуска антибиотиков, предназначенных для инъекций, препараты должны быть стерильными; получение таких антибиотических препаратов, приготовление различных лекарственных форм, дозировка (расфасовка) и упаковка должны осуществляться в асептических условиях.

Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающих подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Весь этот комплекс мер включается в понятие «управляемый биосинтез».

В промышленных условиях управляемый биосинтез требует строгого соблюдения технологического процесса как на стадии подготовки инокулята, так и на стадии биосинтеза. На стадии подготовки инокулята особое внимание обращают на состав среды, на которой выращивается организм, на возраст клеток или мицелия. На стадии биосинтеза, кроме состава среды, большую роль играют скорость потребления тех или иных компонентов, предшественники, регуляция процесса аэрации культуры, поддержание соответствующих температуры и рН среды и других показателей режима культивирования.

В современных условиях производства принимают меры к максимальному снижению себестоимости препаратов путем интенсификации всех стадий технологического процесса и, прежде всего, повышением эффективности первой стадии - биосинтеза антибиотического вещества.

Для этого необходимо:

а) внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов - продуцентов антибиотиков;

б) создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах;

в) широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с целью оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика;

г) применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с автоматизированными контролирующими устройствами основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика.

Подготовка посевного материала

Подготовка посевного материала - одна из ответственейших опе­раций в цикле биотехнологического способа получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментаторе, так и биосинтез антибиотика. Продуцент обычно выращивают на богатых по составу натуральных средах, спо­собных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроор­ганизмов. Подготовка посевного материала - процесс многоступенча­тый (рис. 1).

Рис. 1 Схема многоступенчатого приготовления посевного материа­ла А - выращивание во флаконах, Б - в колбах на качалках: 1 - законсервированный исходный материал; 2 - споровая генерация на ко­сом агаре в пробирке; 3 - II споровая генерация на твердой среде в сосуде; 3 а и 3б - I и III генерации на жидкой среде в колбе; 4 - ферментатор предварительного инокулирования; 5 - ферментатор инокулирования; 6 - основной ферментатор

Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирке (1, 2), затем из пробирки делают высев в колбы с жид­кой питательной средой и проводят две генерации при глубинном вы­ращивании на качалках в течение двух-трех суток для каждой генерации (3а и 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в не­большой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор 5 (100-500 л), откуда и делают посев в основной ферментатор 6. Для посева в основной ферментатор используют от 5 до 10 % посевного материала (инокулята).

Контроль препарата

Готовый антибиотик подвергается тщатель­ному контролю: биологическому и фармакологическому.

При биологическом контроле ставится задача выяснения стериль­ности готового препарата. Для этого обычно используют два метода.

Первый связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соот­ветствующую питательную среду. Например, биологический контроль бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, проводится следующим образом. В пробирки, содержащие тиогликолевую среду, вносят фермент пенициллазу в количестве, спо­собном полностью инактивировать пенициллин. Пробирки с пеницилла-зой выдерживают двое-трое суток при температуре 37 ^оС для контроля стерильности фермента, затем в них вносят раствор пенициллина. Про­бирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37 ^оС, а другую - при 24 ^оС в течение пяти суток. Ведут ежедневное наблюдение за воз­можным развитием микроорганизмов.

Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяет­ся тем, что для большинства этих соединений не имеется инактиваторов их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выяв­ляют устойчивые к ним формы микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной микрофлоры. Для определения возможного присутствия в таких препаратах чувствительной к ним мик­рофлоры раствор антибиотика пропускают через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,75 мк.

Фармакологический контроль.

К антибиотическим веществам, ис­пользуемых в медицинской практике, в соответствии с Государственной Фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическо­му применению, должен пройти всесторонние испытания на токсич­ность, пирогенность и другие свойства, жизненно важные для организ­ма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на кровь, ЦНС, дыхание и т. д.). Показатели острой токсичности - один из критериев качества ан­тибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика; дозу, вызывающую гибель 50 % подопытных животных (LD₅₀) и смертельную дозу (LD₁₀₀). Только после всесторон­него и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению.

Производство пенициллинов

В 1871 г. В .А. Манасеиным было установлено, что зеленая пле­сень Penicillium glaucum при своем росте уничтожает бактерии, попа­дающие в культуральную среду. Это свойство Penicillium было тогда же использовано врачом А. Г. Полотебневым, применившим смоченные этой плесенью повязки при лечении гнойных ран и язв.

Выдающееся открытие русских ученых не получило широкой из­вестности, и в 1928 г. англичанин Александр Флеминг вторично обна­ружил способность плесневого грибка Penicillium угнетать рост микро­организмов. Было показано, что вызываемая плесенью гибель микробов обусловлена образованием неизвестного органического вещества, названного пенициллином.

Однако выделение пенициллина в чистом виде в то же время осу­ществлено не было, так как он оказался веществом очень лабильным, а применявшиеся методы очистки были несовершенны.

В годы Второй мировой войны огромная практическая потреб­ность в эффективных антибактериальных препаратах привлекла к пени­циллину внимание широкого круга специалистов, и примерно с 1939 г. начался период интенсивных исследований. Благодаря этому в относи­тельно короткий срок (3-5 лет) англичанами Х. Флори и А. Чэттеном были разработаны способы промышленного получения и очистки пени­циллина, изучены его лечебные свойства и методы клинического при­менения, а также установлена его химическая структура.

К пенициллинам относится группа близких по химическим свой­ствам соединений, содержащих в своей структуре b-лактамное и тиазо- лидиновые кольца:

R может иметь различные значения, в зависимости от типа пени­циллина. Например, при R = -CH₂C₆H₅ - это бензилпенициллин; R = - СН₂-О-С₆Н₅ - это феноксиметилпенициллин и т. д. Наличие кар­боксильной группы придает молекуле пенициллина сильные кислотные свойства, поэтому пенициллин легко образует соли со щелочами (Na, K), а также с органическими основаниями, например с дибензилэтилендиамином (препарат - бициллин).

Для практических целей медицины пенициллин получают в про­мышленности путем биосинтеза.

Процесс биосинтеза складывается из следующих стадий:

1) выращивания посевного материала (микроорга­низмов) в аппаратах малой емкости - инокуляторах;

2) выращивания посевного материала в больших посевных аппаратах;

3) процесса фер­ментации;

4) выделения антибиотика из культуральной жидкости и его очистки.

Важное значение имеет также селекционный подбор высокопро­изводительных штаммов плесени, подготовка и стерилизация питатель­ной среды и аппаратуры.

Очень важное значение для высокого выхода пенициллина имеет питательная среда, примерный состав которой (в %) следующий:

Кукурузный настой - 3 (по объе­му)	Сульфат цинка - следы
Лактоза (или глюкоза) - 2 (по ве­су)	Карбонат кальция - 0,25
Нитрат натрия - 0,6	Магний сернокислый гептагидрат - 0,05
Калий фосфорнокислый (одноза- мещенный) - 0,15	Вода ~90

Вместо какурузного настоя успешно применяется мука из хлопко­вых семян или мясные гидролизаты.

Приготовленную питательную среду подвергают стерилизации. Процесс ведут в колоннах непрерывного действия. Далее питательная среда поступает в аппарат-выдерживатель, где охлаждается в течение определенного времени до температуры 23-25 ^оС.

Первая стадия процесса - выращивание стандартной колонии штаммов плесени Penicillium chrysogenum - проводится в инокуляторах на питательной среде, где процесс идет ~30 часов. Подготовленный инокулят передают в посевной аппарат, объем которого ~ в 10 раз больше объема инокулятора. В посевном аппарате находится также сте­рилизованная питательная среда. Процесс роста здесь идет ~15-20 ча­сов, и далее посевной материал передается на ферментацию в большие реакторы - ферментаторы объемом до 100 м на питательную среду. Процесс ферментации идет ~70 часов при температуре 23-24 ^оС, рН среды 6-6,5 и постоянной аэрации воздуха - 1 л воздуха/1 литр пита­тельной среды/1 мин по всему объему ферментатора. Основная задача этого процесса - создание оптимальных условий для развития продуцента и накопления антибиотика. Биосинтез анти­биотика - двухфазный процесс. В течение первой фазы происходит быстрый рост и размножение мицелия или бактериальных клеток. Куль- туральная жидкость в этот период богата углеводами, азотом и неорга­ническим фосфором. Продукты обмена веществ микроорганизмов, в том числе и антибиотики, находятся в малых количествах.

Вторая фаза начинается с момента замедления роста культуры. Протекает она в культуральной жидкости, обогащенной продуктом жизнедеятельности организма с небольшим количеством углеводов и фосфора. В начале этой фазы мицелий обладает максимальной способ­ностью к синтезу антибиотика. Фазы отличаются характером и интен­сивностью биохимических реакций. С учетом этих различий подбирают условия, благоприятные для первой и второй фаз развития продуцента.

Для увеличения выхода антибиотика в питательную среду вводят «предшественники», т. е. химические вещества, способствующие целе­направленному синтезу антибиотика. Так, в питательную среду при биосинтезе пенициллина вводят «предшественник» фенилацетамид - это увеличивает выход антибиотика более чем в 2 раза.

По окончании процесса ферментации культуральную массу пере­дают на процесс выделения антибиотика.

Рис. 3 Схема производства антибиотиков в процессе микробного синтеза

Большинство продуцентов при биосинтезе выделяют антибиотик в водную фазу, поэтому процесс выделения антибиотика начинается с разделения твердой и жидкой фаз.

Твердая фаза, кроме массы мицелия, содержит значительное ко­личество коллоидных примесей, затрудняющих фильтрование, поэтому культуральную массу предварительно подвергают различным типам ко­агуляции (электролитической, тепловой, кислотной и т. д.). Наиболее эффективным методом коагуляции культуральной массы является ее обработка флокулянтами (высокомолекулярными полиэлектролитами), например, поли-(4-винил)-Ы-бензилтриметиламмонийхлоридом.

Оставшийся от фильтрации мицелия водный раствор антибиотика направляют на химическую очистку и выделение.

Таким образом, водный раствор пенициллина направляют после фильтрации на экстракцию бутилацетатом при рН водной среды, равной 2. При таком значении кислотности среды подавляет кислотная иониза­ция пенициллина в водной фазе и он переходит в органическую фазу (в бутилацетат). Реэкстракцию пенициллина из бутилацетата проводят слабыми растворами щелочей.

Широко применяются сорбционные методы выделения и очистки антибиотиков. В качестве сорбентов широко используются синтетиче­ские ионообменные смолы.

Сушат пенициллины методом сублимации или распыления.

Широкое и успешное использование антибиотиков в медицине привело к их использованию и в других областях, в том числе:

- в ветеринарии (с теми же целями, что и в медицине);

- для борьбы с некоторыми болезнями растений бактериального и грибкового происхождения;

- в качестве добавки к кормам животных, так как они ускоряют рост и увеличивают степень превращения кормов в мясо;

- в качестве консервантов скоропортящихся продуктов;

- для подавления бактериальной флоры при осуществлении раз­личных процессов при производстве вакцин.

Наука об антибиотиках продолжает быстро развиваться. С одной стороны, продолжаются поиски новых, еще более эффективных препа­ратов биотехнологии, в том числе с иммуностимулирующим, противо­опухолевым, противовирусным действием, с другой стороны, расширя­ются работы по химическому синтезу производных этих веществ и хи­мической модификации природных антибиотиков.

Введение

После установления высоких лечебных свойств первого антибио­тика - пенициллина сразу же возникли задачи организации его произ­водства в больших количествах. На первом этапе промышленное полу­чение этого препарата носило примитивный, экономически нерента­бельный характер. Выращивание продуцента антибиотика осуществля­лось на средах, находящихся в небольших сосудах, при поверхностном культивировании гриба. Процесс развития гриба продолжался 8-10 су­ток. Такой способ культивирования гриба при большой затрате труда да­вал весьма низкий выход антибиотика, и себестоимость препарата была соответственно очень высокой. В результате поисков путей наиболее ра­ционального способа производства антибиотика был предложен метод глубинного выращивания гриба в специальных емкостях- ферментаторах при продувании воздуха и перемешивании культураль­ной жидкости.

Современное промышленное получение антибиотиков - это сложная многоступенчатая биотехнологическая схема, состоящая из ря­да последовательных стадий:

1. Стадии биосинтеза (образования) антибиотика.

Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии - создание оптимальных усло­вий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.

Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма, в том числе стоимости применяемых предшественников, а также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием продуцента антибиотического вещества.

2. Стадии предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделение культу- ральной жидкости от биомассы продуцента).

Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно).

3. Стадия и выделения и очистки антибиотика.

На этой стадии, в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества, применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются экстрация, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка.

Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первой стадии работы имеют дело с небольшой концентрацией (~1 %) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах его концентрация увеличивается до 20-30 %. Все это требует применения различных емкостей и объемов используемых реагентов.

4. Стадии получения готовой продукции, изготовления лекар­ственных форм, расфасовки.

Особенность стадии определяется очень высоким требованиям к качеству конечного продукта. В случае выпуска антибиотиков, предназначенных для инъекций, препараты должны быть стерильными; получение таких антибиотических препаратов, приготовление различных лекарственных форм, дозировка (расфасовка) и упаковка должны осуществляться в асептических условиях.

Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающих подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Весь этот комплекс мер включается в понятие «управляемый биосинтез».

В промышленных условиях управляемый биосинтез требует строгого соблюдения технологического процесса как на стадии подготовки инокулята, так и на стадии биосинтеза. На стадии подготовки инокулята особое внимание обращают на состав среды, на которой выращивается организм, на возраст клеток или мицелия. На стадии биосинтеза, кроме состава среды, большую роль играют скорость потребления тех или иных компонентов, предшественники, регуляция процесса аэрации культуры, поддержание соответствующих температуры и рН среды и других показателей режима культивирования.

В современных условиях производства принимают меры к максимальному снижению себестоимости препаратов путем интенсификации всех стадий технологического процесса и, прежде всего, повышением эффективности первой стадии - биосинтеза антибиотического вещества.

Для этого необходимо:

а) внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов - продуцентов антибиотиков;

б) создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах;

в) широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники с целью оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика;

г) применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с автоматизированными контролирующими устройствами основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика.

Методы культивирования продуцентов антибиотиков

В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов-продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно подается стерильный воздух, и среда перемешивается.

Существует четыре основных модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.

1. Периодическое культивирование.

При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

2. Отъемный метод.

Культивирование микроорганизмов осу­ществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питатель­ной средой до исходного уровня.

3. Батарейный способ.

Микроорганизмы развиваются в ряду по­следовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из пер­вого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобож­денный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной сре­дой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания мик­роорганизмов емкости используются более рационально.

4. Непрерывное культивирование.

В основе метода лежит прин­цип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддер­живать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биоло­гически активного соединения.

Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную био­массу, а во втором аппарате обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования - перспективное направление современной биотехно­логии.