Задача № 6. Охарактеризовать реакцию связывания комплемента.

Для этого надо знать:

Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу в 1901. Которые установили, что при образовании комплекса антиген – антитело происходит связывание им комплемента.

Образовавшееся соединение мелкодисперсно и не определяется визуально. Для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы применили индикаторную гемолитическую систему: эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется, комплемент остаётся свободным. Комплемент адсорбируется только на комплексе антиген - антитело, отдельно на антигене или антителе он не адсорбируется. Поэтому при добавлении к испытуемой системе гемолитической системы, состоящей из уже готового комплекса антиген - антитело (эритроциты барана и антитела к ним), комплемент присоединяется к этому комплексу, вызывая гемолиз эритроцитов барана - видимый результат.

Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РСК применяется в серодиагностике гонореи, сифилиса, коклюша, всех риккетсиозов, многих вирусных заболеваний. Как и другие серологические реакции, РСК можно применить и для серотипирования.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют две системы антиген - антитело и комплемент.

Для постановки РСК необходимы:

Сложность реакции обуславливается количеством участвующих ингредиентов и, главным образом, необходимостью определять точные количественные соотношения их. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование её ингредиентов.

Гемолитическая сыворотка готовиться в производственных условиях путем 3-4 кратной внутривенной иммунизации кролика 50 % взвесью бараньих эритроцитов и инактивируется при 56°С в течение 30 мин. Для её титрования берутся последовательно уменьшающиеся дозы (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% взвесь эритроцитов, комплемент 1:10 в равных объёмах (но 0,5 мл). На этикетке ампул с гемолитической сывороткой обозначен её титр - максимальное разведение, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента в течение часа при 37°С. Для РСК используют разведение сыворотки, увеличенное против титра в 3 раза.

Взвесь эритроцитов барана 3% получают из дефибринированной крови барана путем отмывания изотоническим раствором NaCl.

Комплемент - свежая сыворотка крови морской свинки или высушенная - титруется перед опытом: последовательно уменьшающиеся дозы (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + гемолитическая система (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате при 37°С определяют титр комплемента - наибольшее разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%, т.к. активность комплемента в опыте может оказаться несколько подавленной другими комплементами реакции (антиген, сыворотка).

Антиген - взвесь убитых микроорганизмов, их лизаты, полные антигены, гаптены, экстракты тканевых липидов -иногда связывает комплемент даже в отсутствии иммунной сыворотки, поэтому его также необходимо оттитровать. Берутся последовательно уменьшающиеся дозы антигена + рабочая доза комплемента + гемолитическая система. Титром антигена является его наименьшая доза, при которой наступает отчётливый гемолиз. Для РСК берут дозу антигена, вдвое уменьшенную против титра во избежание связывания комплемента.

Исследуемая сыворотка перед опытом подвергается инактивированию при 56°С в течение 30 мин. Для инактивирования её собственного комплемента.

Все компоненты реакции связывания комплемента берутся в равных объёмах.

Постановка основного опыта.

После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК. В реакции участвует также титрованные сыворотки: заведомо здорового и заведомо больного (отрицательно и положительная сыворотки соответственно). Как и испытуемую сыворотку, контрольные - тоже инактивируют при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в две фазы:

I фаза - специфическая - инкубация смеси антигена, антитела и комплемента в термостате при 37°С в течение 30 мин.

II фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (предварительно помешенной на 30 мин. в термостат) и инкубации в термостате при 37°С в течение 20 -30 мин.

Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл.). Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной, когда жидкость интенсивно окрашивается ("лаковая кровь"). Степень интенсивности гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величине осадка эритроцитов на дне (+ + + +, + + +, + +, +).

Учёт результатов РСК

Учитывать результаты опыта (испытуемой сывороткой) можно лишь в том случае, если все контроля прошли правильно.

В пробирке №2 с положительной сывороткой (содержащей антитела к данному антигену) гемолиза не должно быть, т.к. комплемент связан в первой специфической системе, а гемолитическая система осталась без комплемента - эритроциты оседают на дно, надосадочная жидкость прозрачна.

В пробирке №3 с отрицательной сывороткой, сывороткой здорового человека, не содержащей антитела к данному антигену, гемолиз должен быть, поскольку в первой фазе реакции не произошло образование комплекса антиген -антитело (из - за отсутствия антител к данному антигену) и комплемент остался свободным. При добавлении гемосистемы во II фазе реакции комплемент адсорбировался на готовом иммунном комплексе эритроциты барана плюс антитела к ним; произошел лизис эритроцитов барана (гемолиз).

Наличие гемолиза в контроле сыворотки и антигена (пробирки №4 и 5) указывает, что их дозы были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемента не связывают. Оставшийся свободным в специфической системе комплемент адсорбируется иммунным комплексом гемолитической системы, происходит гемолиз.

Гемолиз в контроле комплемента (пробирка №6) свидетельствует об активности комплемента и правильности выбора его рабочей дозы.

В контроле гемолитической системы (пробирка №7) при правильной работе этой системы не должно быть даже следов гемолиза, т.к. в ней отсутствует комплемент.

При безупречных контрольных результатах можно учитывать опыт (пробирка №1). Отсутствие гемолиза расценивают как положительный результат. Он свидетельствует о том, что в испытуемой сыворотке обнаружены антитела к данному антигену (человек болен). При соответствии антигена антителу образуется комплекс антиген - антитело, который связывает комплемент (I фаза). При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов во II фазе не будет. Наличие гемолиза является отрицательным результатом, свидетельствующим об отсутствии антител к данному антигену (человек здоров). Комплемент остается свободным и при добавлении гемолитической системы присоединяется к комплексу эритроцит - гемолизины, вызывая гемолиз.

Занятие № 14