Культивированные этапы животных клеток

напр-ия культ-ия животных кл. : 1. культура кл. ; 2. культура органов и тканей. Культуры кл. лишены структ-ой орг-ии, не имеют биохим. признаков и ,обычно, не достигают равновестного состояния при отс-ии спец. условий. Кл. в культуре размнож-ся, что обеспеч-ет получ-ие их большой массы. Далее их идентифицируют. Отбор ведут по фенотип. признакам путём выращ-ия на селект. среде, или опред-ют генотипически. Затем их разделяют на одинаковые параллели и по необх-ти сохраняют. Выделены след. типы культур: эл-ты соед-ой тк.; скелет. тк.; эпит. тк.; кл. НС; эндокрин. кл.; различ. опухолевые. Популяция кл. не всегда гомогенна, т.е. не всегда фиксирована по фенотипу. Свежевыделенные культуры – первичные культуры (до начала пасирования). Кл. первичной культуры гетерогенны и хар-ся низкой пролиферацией(увел-ие числа кл. путём митоза). В этих кл. наиболее полно представлены типы той тк., из кот. были получены. Пасирование обесп-ет возм-ть продление сущ-ия культуры, возм-ть клонирования, исслед-ия и сохр-ия св-в кл. При этом увел-ся однородность культуры. Появление постоянной линии кл. опред-ся по морф-им изменениям( умен-ие размера кл., округление). 2 с-мы культ-ия: 1. непроточные культуры – тип культуры, в кот. кл. вводят в фиксир-ый объём среды. В проц. роста происходит исп-ие пит. в-в и накоп-ие метаболитов, поэтому среда должна меняться. Увел-ть продолж-ть жизни непроточных культур м-о след. сп-ми: прерывистый ( часть культ. замен-ся равным объёмом среды); постоянный (объём культуры увел-ся постепенно, но медленно); перфузионный ( постоянное поступление свежей среды и удаление равного объёма субстрата). 2. проточные культуры – культуры, кот. обеспеч-ют истинные гомеостат-ие условия без изменения пит. в-в и метаболитов. Гомеостаз обусловлен постоянным поступление среды и, одновременно, удалением метаболитов.

 38.типы культуральных систем животных клеток:непроточные и проточные

Существует 2 осн. сис-мы культивиров. клеток.

Непроточные культуры - тип культур, в кот. клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использ-ие пит. в-в и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в рез-те истощения среды происх. прекращение пролиферации клеток. Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами: • прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды); • постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются); • перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды).

Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее рН и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд. Все сис-мы непроточ- культур характер-ся накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий. 2. Проточные культуры обеспеч-ют истинные гомеостатические условия без изменения конц. пит. в-в и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

39.монослойные и суспензионные культуры животных клеток;

Сущ. 2 крупных направления в культивировании животных клеток: монослойные культуры и суспензионные культуры. Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток. Представ. собой относительно гомогенную популяцию клеток, кот. легко подвергнуть воздейств. хим. в-в. Суспензионные культуры удобнее для проведения биохим. и молек-биолог. экспериментов - изучения индукции ферментов и связи их с событиями клет. цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов. Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:

1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты. 2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток. 3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату. 4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований. 5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты. Недостатками монослойных культур являются: • требования большого пространства; • возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;• недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы; • сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода.

40.диплоидные и постоянно перевиваемые культуры;

Диплоидные клеточные штаммы. Это клетки одного типа, способные претерпевать in vitro до 100 делений, сохраняя при этом сбой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов, полученные из эмбрионов человека, широко используются в диагностической вирусологии и при производстве вакцин, а также применяются в экспериментальных исследованиях. Следует иметь в виду, что некот. возможности вирусного генома реализуются лишь в клетках, сохраняющих нормальный уровень дифференцировки. Перевиваемые клеточные линии. Это клетки одного типа, способные неопределенно долго размнож. in vitro. Такие «бессмертные» линии обычно ведут свое происхождение от опухолей или трансформированных диплоидных клеточных штаммов. Часто они теряют сходство с теми клетками, от которых произошли, так как в течение длительного культивирования претерпевают многочисленные последовательные мутации. Наиболее распространенным показателем этих изменений является дедифференцировка, т. е. исчезновение тех морфологических и биохимических особенностей, которыми клетки обладали in vivo. Клетки перевиваемых линий часто анеуплоидны и могут давать опухоли при трансплантации животным. Перевиваемые клеточные линии НЕр-2, HeLa и KB, ведущие начало от карцином человека, поддерживают размножение многих вирусов. Эти линии, а также линии, происходящие от клеток тканей мышей (L929, ЗТЗ) и хомячков (ВНК-21), широко используются в экспериментальной вирусологии Большое преимущество перевиваемых клеточных линий в том, что их можно размножать сколь угодно долго, пересаживая клетки через определенные промежутки времени. Более того, клетки сохраняют жизнеспособность в течение многих лет, если их хранить при низкой температуре (от —70 до — 196°С) в виде суспензии в глицерине или диметилсульфоксиде. Так как клетки при серийном пассировании неизбежно изменяются, в лаборатории обычно хранят при низкой температуре большое число ампул с клетками и используют их в качестве посевного материала для получения партий, удовлетворяющих требованиям эксперимента. Некоторые перевиваемые клеточные линии были адаптированы к росту в так называемой суспензионной культуре, т. е. в суспензии отдельных клеток, которая постоянно перемешивается вращающимся магнитом. Такие культуры особенно удобны при биохимическом изучении размножения вирусов и при промышленном производстве вакцин.

41.популяция к-к, клоновые линии;

Клеточная популяция (К.п.)- группа однородных по определ. критерию клеток. По способности к обновлению выделяют 3 типа: Стабильные - не способны к обновлению (нейроны млекопитающих). Число клеток в таких К. п. стабилизируется в начале их дифференцировки и они утрачивают способность к делению. К концу жизни организма число клеток в стабильных К. п. несколько снижается. Растущие - способны не только к обновлению, но также к росту, увеличению массы ткани за счёт увеличения числа клеток и их полиплоидизации (клетки печени и некот. др. желёз). Обновляющиеся –хар-ся закономерным обновлением клеток: сколько их гибнет, столько появляется новых за счёт делений и специализации слабодифференцированных стволовых клеток (клетки кишечного эпителия или крови).