Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток

Метод широко применяется в тех случаях, когда наибольшая активность трансформации приурочена к определенной фазе раз­вития культуры микроорганизма или если трансформируемый субстрат может разлагаться культурой до конечных продуктов, а процесс метаболизма необходимо остановить на определенном этапе.

Метод сравнительно легко применим в тех случаях, когда трансформация осуществляется грибными культурами, мицелий которых возможно без особых затруднений отделить от среды вы­ращивания в нужный момент и ресуспендировать в буферном растворе или водопроводной воде, где и осуществляется транс­формационная реакция. Метод трансформации суспензиями неразмножающихся клеток позволяет использовать культуру опре­деленного физиологического состояния. Так, 11-гидроксилирование кортексолона с помощью Tieghemella orchldis233 наиболее интенсивно осуществляется 19-часовым мицелием.

Трансформация ацетата кортизона в кортизон (гидролиз) Actinomyces corymbosusнаиболее активно осуществляется 24-часовой куль­турой мицелия в период ее перехода в стационарную фазу.

Трансформация осуществляемая спорами грибов и актиномицетов

Трансформация органических веществ спорами имеет ряд особенностей, представляющих интерес в связи с практическим исполь­зованием. Эти процессы обычно осуществляются в простых сре­дах — дистиллированной или водопроводной воде, буферных растворах. Иногда для этого требуются добавки органических веществ в небольших концентрациях. Споры активны после дли­тельного хранения (до трех лет в замороженном состоянии). Если процесс трансформации идет в бедной среде, то споры мо­гут быть отмыты и использованы еще 4-5 раз. Оптимум рН обычно выражен менее четко, чем у вегетативных клеток. Это позволяет использовать условия, предотвращающие заражение посторонними микроорганизмами. Подобные наблюдения стиму­лировали попытки применения трансформации с использованием спор в промышленных масштабах. Такая возможность продемон­стрирована на следующих процессах: 11а-гидроксилирования прогестерона и кортексолона спорами Aspergillus ochraceus; 1-дегидрогенизации кортексолона спорами Septomyxa affinis; 1la-гидроксилирования 6а-, 16а-, 17а-диоксипрегн-4-ендиона в нестерильном 200-литровом ферменте. В последние годы осуществлен гидролиз феноксиметилпенициллина спорами Fusarium sp. Конидии Aspergillus candidusNRRL 305 синтезировали, манит из глюкозы с 75%-ным выходом. Появились работы по иммобилизации спор в полиакриламидный гель, что дает возможность применения непрерывно действующих колонок. Таким образом, были осуществлены гидролиз сахарозы и многочисленные трансформации стероидов.

Непрерывные методы культивирования

Преимущество непрерывного культивирования по сравне­нию с периодическим при получении биомассы клеток стимули­ровали его применение для синтеза микробных метаболитов. Процессы получения продуктов, непосредственно связанные с ростом микроорганизмов, в условиях непрерывного культивиро­вания осуществляются сравнительно легко. Образование микроб­ных метаболитов, не связанное с ростом, потребовало больших усилий для реализации процессов непрерывным методом, и хотя многие из них осуществлены в лаборатории, внедрение этого ме­тода в практику сопряжено с рядом затруднений. Одним из недостатков непрерывного метода, имеющим существенное значе­ние, является то, что в периодической культуре легче получить максимальный выход продукта на единицу субстрата, в то время как в проточной культуре часть субстрата обычно не превраща­ется. Однако более детальное и углубленное исследование не­прерывной трансформации сорбита в сорбозу культурой Acetobacter suboxydans, прогестерона в 11α-оксипрогестерон культу­рой Aspergillus ochraceus, прегнандиена в прегнатриен с по­мощью Septomyxa affinisи т. д. наглядно продемонстрировали рентабель-ность и преимущества этого метода.

Непрерывные методы микробной трансформации получили интенсивное развитие благодаря разработке метода иммобили­зации спор, клеток и ферментов.

Кометаболизм

Кометаболизм— процессы трансформации или полного раз­ложения органических соединений, осуществляемые микроорга­низмами сопряженно с метаболизмом других субстратов – косубстратов,которые не являютсяростовыми. Так, упомянутое выше окисление нокардиями п-ксилола или 3-метилпиридина в соответствующие кислоты без косубстратов на питательной среде, содержащей такие соединения, как глюкоза и ацетат, происходит медленно. В присутствии же ксилозы или глицерина активность трансформации резко возрастает. Важно отметить, что глюкоза и ацетат являются оптимальными ростовыми субстратами для культур, осуществляющих описываемые процессы, в то время как ксилоза лишь частично окисляется, но не используется ими в качестве источника углерода, а глицерин поддерживает лишь медленный рост. Таким образом,оптималь­ные ростовые субстраты - глюкоза и ацетат- не стимулируют трансформацию и, следовательно, не являются косубстратами.

При использовании метода растущих культур накопление про­дуктов трансформации на средах с глюкозой и ацетатом, но без косубстратов, про­исходит лишь в связи со значительным увеличением массы кле­ток в культуре, которые имеют низкую удельную активность. В вариантах же с глицерином или ксилозой даже при медленном росте или в его отсутствие удельная активность трансформации значительно выше, что и стимулирует значительное накопление продуктов даже при низкой плотности клеточной культуры. Такие процессы и называют кометаболизмом; он обнаруживается при сравнении удельных скоростей про­цессов трансформации на различных средах.

Механизм сопряжения между трансформацией и метаболиз­мом косубстрата, приводящего к интенсификации первого про­цесса, изучены слабо. По всей вероятности такое сопряжение заключается в использовании в первом процессе каких-то мета­болитов, образующихся во втором процессе и обеспечивающих первый энергией и (или) кофакторами. Поэтому кометаболизм играет важную роль в тех случаях, когда в метаболической сис­теме микроорганизма отсутствует или недостаточно совершенна координация метаболических путей. Именно поэтому условия кометаболизма бывают, необходимы микроорганизму для превращения необычных для него субстратов (например, упомянутых выше п-ксилола и 3-метилпиридина).

Поскольку косубстрат играет в процессе кометаболизма спе­цифическую и вполне определенную роль, правильный его выбор имеет важнейшее значение. В некоторых случаях, когда фермен­тативный механизм трансформации известен, выбор косубстрата не составляет труда. Так, для интенсификации процесса восста­новления карвона в дигидрокарвон культурой Pseudomonas ovalisв качестве косубстрата был выбран этанол потому, что данный микроорганизм имеет активную НАД-зависимую алкогольдегидрогеназу, окисляющую этанол в ацетальдегид; последняя обеспечивает трансформацию карвона восстанови­тельными эквивалентами (НАД*H):

C₂H₅OH + HAD ----- CH₃COH + НАД*H

В случаях, когда механизм процесса неясен, косубстраты приходится подбирать путем проверки разных соединений. Окис­лительные процессы кометаболизма иногда называют соокислением (под таким названием они были описаны впервые амери­канским микробиологом Фостером), восстановительные — совосстановлением.