Молекулярно-Биологическое Обеспечение
NCBI-Национальный центр биотехнологической информации, США
ЭБИ Европейского института биоинформатики института, Hinxton, UK
INRA Institute National de la Recherche Agronomique, France
Последовательность исследования:
Entrez на NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/
SRS 6.0.7.2 на ЭБИ http://srs.ebi.ac.uk/
Зонды и праймеры дизайн:
АРБ
Strunk et al., 1993, Мюнхен
ДНК-Star
Лазер Гены Inc. Мэдисон, Висконсин, США
Primer Калькулятор http://www.williamstone.com/primers/calculator/calculator.cgi
William Stone Enterprises, Массачусетс, США
| Page 31 |
2. Материал и методы
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Инструменты Выравнивания:
ClustalW на ЭБИ http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/
MultAlin в INRA http://www.toulouse.inra.fr/multalin.html
(Corpet, 1988)
Последовательность - зонд и сравнения:
Blast на NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ или
Взрыв на ЭБИ
http://www.ebi.ac.uk/blast2/
FastA на NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/FASTA/ или
FastA на ЭБИ
http://www.ebi.ac.uk/fasta3/
Genedoc 2.5.
http://www.cris.com/∼кетчуп/genedoc.shtml
(Николай и Николай, 1997)
Последовательность анализа:
Промоутер PREDICTION http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
BDGP Berkeley Drosophila Genome Project, США
ORF Finder на NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
DNA sequence translation
и Codon Usage http://alces.med.umn.edu/webtrans.html
Virtual Genome Center, США
Protein Machine http://www2.ebi.ac.uk/translate/
Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon/
Kazusa DNA Research Institute, Япония
Omiga 2.0
Oxford Molecular, США
МВт и пи
http://www.expasy.ch/tools/pi_tools.html
SIM - Alignment Tool
for protein sequences http://www.expasy.ch/tools/sim-prot.html
БЛОКИ
http://www.blocks.fhcrc.org/
InterPro Sequence Analysis http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html
PFAM
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/
PROSITE Pattern Search http://www.expasy.ch/tools/scnpsit1.html
REPuter
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/reputer/doc/doc.html
Гусар
Хайдельберг UNIX Sequence Analysis Resources, GENIUSnet,
Deutsches Krebsforschungszentrum, Хайдельберг
| Page 32 |
2. Материал и методы
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Oligonukleotide
Зонды для детекции бактерий с помощью FISH
Для FISH последовательности в табл. 4 представленных зондами из литературы
взято. Чтобы обеспечить их специфичности, они были ниже в соответствующих
Источники указанных условиях. Для контроля собственного
Условия испытаний испытания проводились hybridisierungen рядом с родственниками
Справочник организмы, которые показали очень похожие целевой последовательности. В качестве мишени для молекулы
Зонды EUB338, LGCa354, LGCc354, LLL68, LLC68 и NON338 служит 16S рРНК,
зонд LLA271 обнаруживает target последовательности на 23S rRNA.
Последовательность зонда LGCa354 и LGCc354 отличается только в 2 базах. Оба
являются специфическими для группы грам-положительных микроорганизмов с низким G+C-
Зарплата. LGCa354 обнаруживает подгруппе Low G+C грамположительных и
Вида Leuconostoc принадлежит, LGCc354 100% отворот дополнением к подгруппе
из Lactococcus принадлежит (Meier et al., 1997).
Зонд
Цель организма
Последовательность (5‘-3‘)
%
Формы
Амид
Литература
EUB338 все Eubakterien
GCTGCCTCCCGTAGGAGT
0-35
(Stahl et al., 1988)
LGCa354 Low G+C грамположительных
Variation A
TGGAAGATTCCCTACTGC
20 и
35%
(Meier et al., 1997)
LGCc354 Low G+C грамположительных
Вариация C
CCGAAGATTCCCTACTGC
20 и
35%
(Meier et al., 1997)
LLA271
L. lactis
CTATAATGCTTAAGTCCACG 20
(Beimfohr et al.,
1993)
LLC68
L. lactis ssp. cremoris
TGCAAGCACCAATCTTCATC 10
(Beimfohr et al.,
1993)
LLL68
L. lactis ssp. lactis
TACAAGTACCAACCTTCAGC 10
(Beimfohr et al.,
1993)
NON338 отрицательный контроль
ACTCCTACGGGAGGCAGC
0-35
(Wallner et al.,
1993)
Tab. 4. Наименование, специфичность, последовательность и формамид зарплата при FISH
используемых зондов.
Зонды были в компании Interactiva (Ulm; сейчас Thermo Hybaid) соответственно на 5'-конце
с карбокси Тетра метил-родамина (TAMRA) или Флуоресцеина (FLUOS) отмечены заказал.
Для Проверки маркировки скорость ТАМРЕ были-отмеченные Oligonukleotide 1:100
в Ч2О, FLUOS-выделенный Oligonukleotide в карбонатного буфера рН 9,0 и разводят в
| Page 33 |
2. Материал и методы
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Фотометр (Hitachi U-3000) самонадеянно. Отношение поглощения Нуклеотидов (OD260) и
Краситель поглощения (OD FLUOS490, ТАМРЕ OD550) позволяет оценить
Ставка маркировки. При полной маркировки измеренное значение равно
Частное двух коэффициентов Поглощения, что веществами, используемыми цвета и
средняя длина используемых Oligonukleotide от 18 баз в FLUOS
значение от 2,5 до 3 и при ТАМРЕ значением 1. соответствует.
Концентрация олиго-нуклеотида проводилось путем определения поглощения при ОД260
по формуле определяется:
1 OD260= 20 мкг/мл ss ДНК Олигонуклеотида
Для рабочих растворов стволовые раствор разводят до 50 нг/мкл и при -20°C
хранить.