Определение токсигенности дифтерийной палочки методом Оухтерлони.

Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.

.24. Произвести учет развернутой РА в пробирках с культурой кишечной палочки при

диагностике колиэнтеритов.

Для установления серологической группы выделенных культур: а) ставят реакцию агглютинации на стекле с поливалентными ОК-сыворотками; поливалентной ОК-сывороткой в течение, для постановки реакции на стекле с каждой типовой ОК-сывороткой, входившей в состав поливалентной смеси. Контролем реакции служит взвесь микробов в капле изотонического раствора хлорида натрия. Реакция агглютинации на стекле с живой культурой имеет только ориентировочное значение, указывая на наличие в ней соответствующего К-антигена, и не может служить основанием для отнесения выделенного штамма к той или иной О-группе. 3. Для окончательной идентификации культур по О - и К-антигену ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с той ОК-сывороткой, которая агглютинировала культуру на предметном стекле. Если положительная агглютинация на стекле имела место с несколькими типовыми сыворотками, развернутую агглютинацию ставят со всеми этими сыворотками. Принадлежность культуры к серологическому типу в таком случае определяют по наивысшему титру с той или иной сывороткой. При постановке развернутой реакции агглютинации готовят два ряда разведений типовой агглютинирующей ОК-сыворотки от 1:50 до титра, указанного на этикетке ампулы. Разведенную сыворотку разливают по 0,5— 1 мл. Для определения К-антигенов в каждую пробирку добавляют трехмиллиардную взвесь живой исследуемой куль- туры кишечной палочки. При определении О-антигена пользуются этой же микробной взвесью, но после предварительного кипячения ее в водяной бане в течение часа для инактивации поверхностнооболочечных антигенов и устранения таким образом феномена О-инагглютинабельности.

Последние две пробирки ряда — контрольные: контроль антигена (КА)—? исследуемая культура в изотоническом растворе хлорида натрия и контроль сыворотки (КС) —сыворотка в разведении 1 :50. Штатив с пробирками встряхивают для лучшего перемешивания сыворотки с антигеном и ставят в термостат на 20 ч. Положительный ответ дают в том случае, если выделенная культура по антигенному строению соответствует той или иной серологической группе энтеропатогенных эшерихий. При этом живая культура образует крупнохлопчатый агглю-тинат с полным просветлением жидкости над осадком не менее чем в 2—3 разведениях сыворотки; прогретая культура выпадает в виде мелкозернистого агглютината до предельного разведения той же сыворотки или до 3Д титра, указанного на этикетке'. Такого рода результат указывает на принадлежность выделенной культуры к соответствующей серологической группе энтеропатогенных кишечных палочек. Образование мелкозернистого агглютината в ряду пробирок с живой и прогретой культурой, в разведениях сыворотки до 3/i ее титра по О-антигену свидетельствует о принадлежности культуры к соответствующей О-группе и отсутствии или низком содержании в ней поверхностных соматических К-антигенов (В или L). Реакция считается положительной. Отсутствие агглютинации в пробирках с гретой культурой указывает на принадлежность выделенной культуры к другой О-группе. Если прогретая культура агглютинируется только в начальных разведениях сыворотки, это свидетельствует о ее принадлежности к другой группе, имеющей антигенное родство с соответствующей О-группой. Реакция считается отрицательной.

25.Реакция ВидаляРеакция агглютинации широко применяется в лабораторной практике для серодиагностики. Реакция агглютинации протекает в две фазы:

1 фаза - соединение антигена с антителом;

2 фаза - адсорбция на комплексе антиген+антитело физиологического раствора и выпадение осадка двух видов:

а) крупнохлопчатого - у жгутиковых бактерий (Н-агглютинация);

б) мелкозернистого - агглютинат образуется в виде компактных зерен (О-агглютинация).

Компоненты реакции Видаля:

1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600;

2) диагностикумы - взвесь убитых сальмонелл трех видов: брюшного тифа, паратифа А и В;

3) физиологический раствор.

Цель реакции: определение титра антител в испытуемой сыворотке.

Реакция агглютинации должна сопровождаться контролем антигена и сыворотки. Реакция ставится в трех рядах. Учет результатов проводят через 18-20 часов.

Степень положительной реакции агглютинации обозначается плюсами: + + + + полная агглютинация + + + неполная агглютинация + + слабая агглютинация - осадка нет (отрицательная реакция) Положительным результатом у людей, не привитых против брюшного тифа, считают агглютинацию в разведении 1:100 при наличии клинической картины и не ниже 1:200 при отсутствии таковой. У привитых больных указанные титры О-антител не являются надежным диагностическим признаком. Диагностический титр Н-антител у ранее привитых больных должен быть не менее 1:400.

26. Реакция Видаля (с культурой дизентерийных палочек) считается доказательной в разведении 1 : 100 для дизентерии типа Зонне и 1 : 200 для остальных типов, наибольшую диагностическую ценность имеет нарастание титра при повторных исследованиях,

При положительной реакции осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его обычно неровные (так называемый зонтик). Надосадочная жидкость просветляется. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадочной жидкости всплывают отдельные хлопья агглютината. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдают хорошо выраженную агглютинацию, считают ее титром. При отрицательной реакции взвесь сохраняет исходную мутность, так же как в контроле диагностикума. При избытке антигена он может осесть на дно в виде плотного комка.

27.Учет результатов РПГА при гриппе. резул-ты р-ции учитыв. По наличию геммаглютинации-рыхлого осадка из склеившихся эритроцитов на дне и боковых поверхностях лунок(«зонтик»).в контролях геммаглют. Не должно быть(появление плотного осадка эритр. В виде пуговки или колечка)

В ряде лунок А-Н наход. 2-х кратные разведения (от 1/2 до 1/1024) 8-ми испытуемых сывороток(в предпоследней положит сывор.,в последней – отриц.)в ряде В и F –р-ция отриц.,в ряде А и Н-РНГА положит. в титре 1/32, С и G- 1/16, D- 1/128,некоторые сыворотки (С и G)дают эффект прозоны.

28. Учет результатов РПГА с эритр диагностикумами. С целью диагностики дизентерии сыворотки титруют с эритроцитарными диагностикумами Флекснера (из S. flexneri 1 - 5), Зонне (из S. sonnei), Минимальным условно диагностическим титром к диагностикуму Флекснера для взрослых считают положительный результат реакции в разведении 1:400, для детей до 3 лет - 1:100, старше 3 лет - 1:200; для остальных диагностикумов - 1:200. В связи с большим числом неспецифических положительных результатов этой реакции, в особенности в отношении диагностикумов Флекснера и Зонне, достоверным положительным результатом следует считать не менее чем четырехкратное нарастание титра в динамике заболевания, а также наличие титра цистеинустойчивых антител 1:80 и выше.

29. Реакция Райта: ставят в начале 2-й недели болезни. Реакцию ставят не менее чем в пяти разведениях (1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и 1:800) в объеме 1 мл каждое. В качестве антигена применяют единый бруцеллезный дианостикум. Перед употреблением диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физиологическим раствором. Учет реакции производят через 24 часа путем сравнения степени просветления в опытных пробирках с соответствующим стандартом мутности, который готовят следующим образом. В 4 пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл разведенного диагностикума, затем в том же порядке добавляют 3, 2 и 1 мл карболизированного физиологического раствора, в последнюю пробирку ничего не добавляют. После взбалтывания содержимого берут по 0,5 мл антигена каждой концентрации и 0,5 мл карболизированного физиологического раствора. Таким образом получают 4 пробирки стандарта мутности с различной степенью просветления (75% — 3—, 50% — 2 — и 25% — 1 — и отсутствие просветления), которые вместе с опытными пробирками помещают в термостат при t° 37° на 24 часа, после чего производят учет реакции. Диагностическим титром исследуемой сыворотки считается 50% агглютинации (2+).

30. Факторы патогенности стафилококков

1. Выявление плазмокоагулазы: выделенную агаровую культуру в виде густой взвези вносят в пробирку с цитратной плазмой кролика и эмульгируют. Пробирки выдерживают в вертикальном положении при 37 гр. и наблюдают за появлением коагуляции- свертывания крови. (+ результат отмечается через 2-6 ч.)

2. Определение ДНКазной активности: культуры стафилококков засевают бляшками в чашку Петри с ДНК-содержащим агаром. Через сутки в чашку вносят соляную кислоту и через 3-5 мин. Наблюдают появление вокруг бляшек зоны просветления, что свидетельствует о наличии ДНКазы.

3. Лизоцимная активность: при выделении лизоцима вокруг колонии стафилококков образуются зоны лизиса микрококка.

4. Выявление продукции энтеротоксина: культуру стафилококков засевают в специальную питательную среду. Инкубация 37 гр. 3-4 суток. Затем фильтруют через мембранные фильтры. Полученный фильтрат смешивают с молоком скармливают котятам. При наличии энтеротоксина через 1 ч. У котят возникает рвота, а через 2-3 ч. Понос, возможен летальный исход.

ЦПД в культуре тканей

Исследуемый материал: испражнения, носоглоточный смывы. Заражают культуру клеток почек обезьян. В культуре вирус оказывает ЦПД. Идентифицируют вирус, проводя РН с типоспецифическими сыворотками и ИФА.

РН. Компоненты: вируссодержащий. материал и диагностическая сыворотка. Готовят разведения сывороток, добавляют вирусод. материал, заражают смесью культуру клеток. Пол. результат: отсутствие ЦПД вируса, бляшкообразования и изменения цвета.

ИФА: Компоненты: специфические АТ, вируссод. материал, АТ той же специфичности, конъюгат, хромогенный субстрат. Связывают специфические АТ с пластиком лунки планшета, вносят вируссод. материал, вносят АТ той же специфичности, конъюгат и субстрат. Пол. результат: изменение окраски субстрата.

32.Учут результатов ИФА Используют в качестве метки АТ ферментов, способных разлагать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов( хромогена). Соединенные с ферментом АТ соединяются с гомологичными АГ. Сначала на твердой фазе адсорбируются АГ или АТ , а потом все компонентты реакции. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ +АТ + фермент. АГ улавливается АТ, присоединенным к твердой фазе( пластиковые планшеты, пленки) . В результате инкубации исследуемый АГ присоединяется к АТ и твердой фазе. Затем привязанный АГ выявляют с помощью меченых ферментом АТ против этого АГ-прямой вариант.При непрямом методе используются меченые ферментом антивидовые сыворотки. Количество присоединенного к твердой фазе фермента соответствует количеству АГ. Активность фермента оценивают по интенсивности окрашивания хромогена визуально или с помощью фотоэлектроколориметра.

33. Произвести учет РГА с целью определения титра вируса.Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда полистероловой микропанели микротитратором разливают физиологи ческий раствор (0,05 или О,25 см3), в первую вносят в равном объеме вакцинный вирус трехкратно пипетируюти и переносят 0,05 или0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или0,025 см3 удаляюти обезвреживают в 2%-ном растворе едкого натрия. После разведения вируса во все лунки вносят 0,7%-ную суспензию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиологического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при команатной температуре (18-20*С). Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию оп ределения времени учета реакции в две лунки с физиологическим растворам (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов. РГА оценивают положительно при оcедании эритроцитов в виде хорошо выраженного "зонтика", отрицательно - в виде "пуговки". За титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию в виде "зонтика". Получение нечетких ре зультатов может быть связано с изменившимся рН физиологического раствора.

34.Учет РТГА Берем 6 пробирок. последняя - контрольная ( контроль эритроцитов). В каждую добавляем ИХН. Затем в каждую добавляем АГ. ( диагностикум) ( кроме шестой) . Затем в первую добавляем сыворотку от больного и титруем. Потом на 30 мин. в термостат . Затем добавим во все эритроциты ( одинаковое количество) . Потом - 30 мин. термостат. Положительный результат - пуговка. Отрицательный - зонтик.

35учет ИФА. По ходу, так же , как и 32, но неточно.