Реакция задержки гемагглютинации.

Реакция задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА, РТГА) широко применяется в практике как для выявления и определения титра антител в сыворотке крови больных и вакцинированных животные, так и для идентификации выделенных вирусов по известной сыворотке. Ставить эту серологическую реакцию можно только с теми вирусами, которые обладают гемагглютинирующими свойствами.

Агглютинация эритроцитов при вирусных инфекциях обнаруживается в результате прямого взаимодействия вируса с поверхностью эритроцитов (реакция гемагглютинации - РГА). РГА наступает непосредственно в смеси гемагглютинирующего вируса с эритроцитами. РГА может быть нейтрализована, если перед взаимодействием с эритроцитами к гемагглютинирующему вирусу добавить специфическую иммунную сыворотку (реакция торможения, задержка гемагглютинации - РТГА, РЗГА).

РГА и РТГА впервые были предложены для обнаружения вируса гриппа и титрования противогриппозных антител. Вскоре появились сообщения о гемагглютинирующей активности вирусов осповакцины, ложной чумы кур, паротита, оспы, пневмонии мышей, кори, арбо-, адено- и парагриппозных, а также кишечных вирусов. Миксовирусы агглютинируют эритроциты многих видов животных и птиц, вирусы оспы и вакцины — эритроциты петухов, арбовирусы и вирус кори — эритроциты обезьян и гусей, большинство неполиомиелитных кишечных вирусов — эритроциты человека.

Реакция гемагглютинации визуально видна в виде хлопьев красного цвета («зонтик») – положительная реакция. При этом осадок эритроцитов – это отрицательная реакция.

Реакция торможения гемагглютинации визуализируется в виде осадка эритроцитов («пуговка») – положительная реакция. При этом хлопья агглютинации – это отрицательная реакция.

Определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом индикаторных дисков.

Важное значение в лечении и профилактике инфекционных заболеваний принадлежит химиотерапии и химиопрофилактике, эффективность которых в значительной степени зависит от чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Среди химиотерапевтических средств, используемых для лечения больных с гнойно-септическими инфекциями, ведущее место занимают антибиотики.

Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам широко используется диско-диффузионный метод. Исследуемую культуру суспензируют в стерильном физиологическом растворе приготовляя 1-миллиардную взвесь по стандарту мутности. Бактериальную взвесь (1 мл) стерильной пипеткой наливают на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри и равномерно распределяют шпателем. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Шпатель и пипетки помещают в стакан с дезраствором. На засеянную поверхность стерильным пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга и отступя 2 см от края чашки бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам. Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируюшим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин).

Рост стафилококка на желточно-солевом агаре.

Для приготовления 20% желточно-солевой агар к 100 мл расплавленного и остуженного до 60⁰С мясо-пептонного агара (рН=7.2) с 10% хлорида натрия прибавляют 20 мл взвеси желтка куриного яйца в стерильном физиологическом растворе. На желточно-солевом агаре обнаруживается лецитовителлазная активность (ЛецА) (способность разрушать лецитовителлин яичного желтка) испытуемых микроорганизмов. Результат оценивается после 24 часовой инкубации в термостате при 37⁰С по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком. Учитывают в отраженном свете

Персистентные свойства микроорганизмов – антилизоцимная активность (АЛА).

АЛА – секреторный фактор персистенции. Изучают АЛА по методике О.В. Бухарина с соавт. (1984). Для этого к 1,5% питательному агару добавляют различные дозы яичного лизоцима (от 1 до 5 мкг) и разливают в чашки Петри. После застывания среды на подсушенную поверхность наносят каплю 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры изучаемого микроорганизма. Чашки инкубируют в термостате при 37⁰С 24 часа, после этого выросшие колонии подвергаются обработке парами хлороформа в течение 20 минут, затем наслаивается слой 0,7% питательного агара с 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича) чувствительной к литическому действия лизоцима. Учет результатов проводится через 24 часа инкубации в термостате по наличию зоны роста микрококка вокруг тех штаммов, которые нейтрализуют внесенный в слой агара яичный лизоцим. Антилизоцимную активность выражают в мкг инактивированного в среде лизоцима.

На данной чашке видны колонии АЛА+ и АЛА- штаммов микроорганизмов. Над колониями АЛА+ штаммов есть рост микрококка в виде мелких желтых колоний.

Лизоцимная активность.

Лизоцим –термостабильный белок, фермент, разрушает клеточную стенку преимущественно грамположительных бактерий, разрывая β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана, что способствует образованию протопластов с последующим их лизисом. Содержится во всех тканевых жидкостях, в лейкоцитах, макрофагах и других фагоцитирующих клетках. Продуцируется лизоцим преимущественно клетками моноцитарно/макрофагального ряда. Лизоцим усиливает антибактериальную активность комплекса антиген (микроб)-антитело-комплемент, способствуя лизису пептидогликана клеточной стенки бактерий. Помимо животного раличают растительный и микробный лизоцим.

Микробный лизоцимявляется одним из факторов колонизации. Лизоцимная активность (ЛА) определяется путем посева исследуемой культуры микроорганизма на питательную среду, содержащую 1 млрд. суспензию суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича). Результат оценивается после инкубации при 37⁰С в течение суток по зоне лизиса в толще среды индикаторного штамма микрококка вокруг изучаемых колоний.

Иммуноферментный метод

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: [AT]+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Принципальная схема иммуноферментного анализа для выявления АТ является следующей. Известный АГ (вирус, белок) – диагностикум фиксируется на твердой фазе. К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными АТ. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему АТ, если таковые имелись в сыворотке обследуемого. Для обнаружения комплекса АГ-АТ, к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки иммунизируют кролика глобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в обследуемой сыворотке есть АТ к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки. После второй промывки образовавшийся комплекс АГ+АТ+АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат на фермент (перекись водорода) и индикатор на продукты расщепления субстрата (хромоген на активные формы кислорода). Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых АТ в сыворотке обследуемого.

Среда Китта-Тароцци.

Питательный бульон с глюкозой и кусочками свежих органов животных. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Сверху среду заливают слоем стерильного масла, которые не пропускает кислород из воздуха в среду. В результате создаются условия для культивирования анаэробных микроорганизмов.