Опыт по выявлению бактерий–мутантов и доказательство спонтанности мутаций тестом перераспределения.

В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной бульонной культуры E.Coli М-17 (посевная доза 1×10⁸ бактерий) и равномерно распределяют шпателем по поверхности питательной среды. Через 6 часов инкубации при 37⁰С в одной из чашек перераспределяют шпателем популяцию бактерий (микроколонии) по поверхности питательной среды, а другую чашку оставляют нетронутой. Выросшие колонии через 24 ч пересевают из каждой чашки методом отпечатков с помощью штампа – репликатора на поверхность питательного агара с рифампицином (100 мкг/мл) в отдельные чашки Петри и инкубируют при 37⁰С. Через 24 ч учитывают результат: на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов; в чашке с перераспределением посевов выросли более многочисленные (в десятки-сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.

Перераспределение бактерий шпателем по поверхности питательной среды без антибиотика не оказывает влияния на число бактерий. Если допустить, что антибиотикоустойчивые мутанты возникают в результате индукции антибиотиком, то после перераспределения и без него на питательной среде с антибиотиком должно вырасти одинаковое число колоний антибиотикоустойчивых мутантов. Если же антибиотикоустойчивые мутанты возникают спонтанно и в отсутствии антибиотика, то результат будет иной. Уже в первой инкубации (через 6 часов) на среде без антибиотика на чашках появляются микроколонии антибиотикоустойчивых клеток-мутантов. Благодаря перераспределению бактерии-мутанты из этих микроколоний распространяются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний, соответственно исходным микроколониям мутантов. Полученный в данном опыте результат доказывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно до контакта бактерий с селективным агентом рифампицином.

3. Опыт по трансформации бактерий:

1) сделать смыв культуры сенной палочки (ауксотрофный штамм, нуждающийся в треонине) и разлить по 0,5 мл в две стерильные пробирки;

2) в первую пробирку добавить о,5 мл раствора ДНК прототрофного штамма, во вторую – 0,5 мл физиологического раствора, поставить в термостат на 30 мин;

3) произвести посев (по 0,1 мл) на чашки с минимальной средой;

4) по демонстрационным посевам учесть рост микробов, записать результат.

Ауксотрофные штаммы микроорганизмов, в отличие от прототрофных, требуют наличия определенных питательных веществ в среде, поскольку сами их синтезировать не могут. На минимальной питательной среде они не растут.

На питательной среде, где сделан посев сенной палочки или ДНК, роста колоний не будет. В третьем секторе, если произошла трансформация и бактерии получили фрагмент ДНК с информацией о ферменте триптофансинтетазе, произойдет рост микроорганизмов.

4. Опыт по коньюгации бактерий:

1) сделать смыв культур E.coli тиминзависимого штамма (Hfr-клетки) и штамма E.coli (F־), нуждающегося в лейцине;

2) по 0,5 мл суспензии каждого штамма смешать в отдельной пробирке и поставить в термостат на 30 мин;

3) произвести высев препарата на чашку с минимальной средой;

4) по демонстрационным посевам учесть и записать результаты опыта.

Посев исходных штаммов микроорганизмов на минимальную питательную среду роста не дает, так как в ней нет необходимых аминокислот. Если произошла коньюгация, то при посеве смеси вырастут колонии кишечных палочек, получивших от Hfr-клеток фрагмент ДНК, ответственный за синтез лейцина и треонина.

5. Опыт по выявлению Col-плазмид.

Исследования проводят методом отсроченного антагонизма по Фредерику. Испытуемые культуры (например, шигеллы Зоне) засевают уколом в 1,5% мясо-пептонный агар по 4-5 штаммов на одну чашку Петри. После инкубирования в течение 24 ч при 37^оС выросшие макроколонии стерилизуют парами хлороформа. С этой целью чашку размещают вверх дном и на внутреннюю поверхность крышки наносят 4-6 капель хлороформа. Через 30 мин хлороформ удаляют, выдерживая чашки с открытой крышкой 15-20 мин. Затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и охлажденного до 48^оС 0,7 % мясо-пептонного агара (5 мл), предварительно смешанного с 0,1% мл шестичасовой бульонной культуры индикаторного штамма (например, E.coli W1655). После суточной инкубации при 37^оС учитывают результат. Бактерии имеют Col-плазмиду (продуцируют колицин), если вокруг их макроколоний образовались зоны подавления роста индикаторной культуры на фоне ее роста сплошным газоном в остальных участках среды. Идентификацию вида Col-плазмид осуществляют этим же методом, используя коллекцию эталонных индикаторных культур с известной резистентностью или чувствительностью к колицинам.

Молекулярно-генетический метод позволяет осуществлять раннюю и более полную диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и осуществлять контроль эффективности терапии.

В настоящее время имеется два направления генетической диагностики:

1 - гибридизационный анализ нуклеиновых кислот

2 - диагностика с использованием амплификации (полимеразная цепная реакция).

Гибридизационный анализ использует способность нуклеиновых кислот в определенных условиях образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Метод детекции инфекционных возбудителей ДНК-гибридизацией оказался крайне трудоемким, длительным и дорогостоящим.

Амплификация– многократное копирование определенного участка нуклеиновых кислот (ДНК, РНК через обратную транскриптазу) в процессе повторяющихся температурных циклов.

Существует большое количество методов амплификации нуклеиновых кислот. В настоящее время предложено подразделить все методы амплификации, в зависимости от технологии на три основные категории.

1. Метод ПЦР, самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (3SR), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ).

2. Амплификация с использованием QB-peпликазы, лигазная цепная реакция (ЛЦР).

3. Амплификация сигнала, при которой усиление сигнала каждой молекулы зонда происходит за счет использования сложных зондов, или технологии разветвленной ДНК.

Все методы амплификации могут быть разделены в зависимости от изменения температурных режимовна:

1) методы амплификации с циклической сменой температурных параметров: (методы ПЦР, ЛЦР и их модификации);

2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот (метод изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающая репликация последовательностей (3SR, NASBA), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB-репликазы.

Этапы амплификации:

1. Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК) из клеток.

2. Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) ДНК (РНК).

3. Детекция продуктов, полученных на втором этапе.

Для детектирования микроорганизмов наиболее часто используется цепная полимеразная реакция - ПЦР (PCR – polymerase chain reaction)

Полимеразная цепная реакция – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК, позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

1. Анализируемый образец – это подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, служащий мишенью для последующего многократного копирования (например, кровь, потенциально содержащая ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

2. Два праймера (соответствуют тому возбудителю, который хотим найти). Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 15-30 нуклеотидов, комплементарных сайтам (участкам) на идентифициуемой матричной ДНК. Тем самым от исследователя зависит, какой участок генома будет копироваться. От правильности подбора праймеров зависит уровень амплификации ДНК.

3. Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов – Thermus Aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Taq-полимераза выделена из водорослей Thermus Aquaticus, живущих в горячих источниках, обладает ДНК-полимеразной активностью. Несколько лет назад удалось получить из бактерий Thermus Thermophilis Tth-ДНК-полимеразу, которая выполняет целый ряд функций, в том числе обеспечивает репарацию и репликацию ДНК, обладает обратнотранскриптазной активностью, позволяя получать из РНК комплементарную ДНК.

4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

5. Ионы Mg2⁺, необходимые для работы полимеразы.

6. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции – рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

7. Положительный контроль – образец ДНК выделяемой биологической системы.

Оборудование. Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации является приборное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР является амплификатор (термоциклер), представляющий собой аппарат, в гнезда которого устанавливаются специальные амплификационные пробирки, изготовленные из особого термопроводимого пластика, с реакционной смесью или предметные стекла с образцами тканей. Различными фирмами выпускается большое количество разнообразных моделей амплификаторов. Модели отличаются друг от друга системами охлаждения (водяное, воздушное, фреоном и более надежное и современное – на полупроводниковых кристаллах), способами обогрева (передача тепла через пробирки с жидкостью и воздушная передача тепла в микроколориметр для обогрева срезов тканей, мазков и т.д.), объемом памяти при программировании, режимами регулирования смены температуры (по матрице, активное), количеством платформ (от 1 до 4). Последние модели осуществляют амплификацию по одной и той же программе на нескольких платформах сразу, что позволяет увеличивать число анализируемых одновременно проб или проводить амплификацию на разных платформах по нескольким разным программам для одновременного анализа проб на наличие нескольких типов возбудителей.

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в ходе реакции амплификации с ней происходит ряд процессов, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Параметры температурного режима играют исключительно важную роль для успешного проведения реакции.

Описанный метод «классической» направленной полимеразной цепной реакции, который используется в тест-системах первого поколения, претерпевает в настоящее время значительные изменения, связанные с разработкой и внедрением различных тест-систем (в том числе и отечественных) для ПЦР-диагностики второго (применяемых для количественного анализа ДНК-РНК), и третьего («сухих» тест-систем, находящихся в стадии разработки) поколений, а также различных модификаций ПЦР (лонг-ПЦР, гнездная ПЦР, РТ-ПЦР, LIPA-ПЦР-технология, ПЦР in situ, мультиплексная ПЦР) и альтернативных методов амплификации нуклеиновых кислот.

Основное отличие тест-систем ПЦР второго поколения (Ген-гем-тест НС) от первого – наличие внутреннего стандарта, который представляет собой ДНК или РНК выявляемого возбудителя в концентрации от 10 до 100 молекул, которая амплифицируется одновременно с фрагментом гена инфекционного агента, но детектируется при этом в виде отдельных сигналов. При этом гарантируется достоверность «отрицательного» результата ПЦР-определения инфекционного агента и своевременного выявления ложноположительных результатов. Наличие внутреннего стандарта при использовании системы видеокомпьютерной детекции позволяет рассчитать концентрацию возбудителя в пробе, т. е. оценить нагрузку (вирусную, бактериальную или иной природы) – количество возбудителя в единице биологического материала. Повысить чувствительность и специфичность тест-системы второго поколения можно при использовании модификации ПЦР, такой как nested-PCR («гнездная» ПЦР) с использованием внутреннего стандарта, что нашло применение в тест-системах второго поколения, рекомендованных для диагностики ВИЧ-инфекции.

Для удобства транспортировки и хранения систем генотестирования, а также для обеспечения стандартности проведения анализов произведена разработка «сухих» тест-систем третьего поколения. Их несомненными преимуществами по сравнению с аналогичными «жидкими» тест-системами являются возможность хранения и транспортировки при любой температуре (от -40°С до +30°С), ускорение и упрощение работы исполнителя. При этом тест-системы третьего поколения позволяют использовать все преимущества тест-систем первого и второго поколения в различных модификациях.

Мультиплексная ПЦР (multi-PCR – multi-polymerase chain reaction). Например, позволяет проводить ПЦР с двумя-четырьмя и более не перекрещивающимися праймерами нескольких возбудителей. Это дает возможность определить в одной пробе нуклеиновые кислоты сразу нескольких возбудителей, что особенно актуально, так как часто при диагностике обнаруживаются смешанные формы инфицирования.

В последнее время для выявления ДНК-мишени используются альтернативные методы, не уступающие по чувствительности и специфичности методикам, основанным на методе ПЦР, но существенно более быстрые по времени выполнения. Принципы этих методов несколько отличны от классического варианта ПЦР.

Детекция продуктов амплификации методом гель-электрофореза. Выявление или детекцию наработанного продукта ПЦР (амплификата) чаще всего проводят при помощи его электрофореза в 2-3% геле агарозы или полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем бромид этидия (специфический интеркалирующий флуоресцентный ДНК(РНК)-краситель). Поглощая ультрафиолетовый свет с максимальной длиной волны 256 нм, бромид этидия, связанный с участком ДНК (ампликоном), способен в соответствии с правилом Стокса флюоресцировать, что регистрируется в видимом спектре (610-620 нм) в виде оранжевой полоски. Получаемые результаты электрофореза ампликонов оценивают в проходящем ультрафиолетовом свете на специальных приборах – трансиллюминаторах и сравнивают с положительным контролем (ДНК выявляемого микроорганизма или известная ДНК). При положительном результате светящаяся полоска ДНК находится на том же уровне, что и положительный контроль вследствие одинаковой молекулярной массы наработанных ампликонов в контроле и изучаемом положительном образце.

Методы повышения количество амплифицированной ДНК (усилить ПЦР-сигнал) при низкой концентрации ДНК-матрицы (вируса, бактерии, мутантных и иных генов):

1 - усиление денатурации ДНК-матрицы: денатурировать ДНК при +94^о-99°С до начала ПЦР или удлинить начальную денатурацию до 3-5 мин.

2 - увеличение специфичности праймеров: при длине 20-30 пар содержание Г + Ц должно составлять около 50%.

3 - применение «горячего старта» – прогревание пробирок с ПЦР-амплификационной смесью (без фермента и магния) при температуре +95°С в течение 3-5 мин (предупреждение амплификации неспецифических ДНК-фрагментов вследствие низкотемпературного неспецифического спаривания праймеров). Суть подхода, получившего название, «горячий старт» (Hot-start), состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг.

4 - применение метода «гнездной» амплификации. Суть его заключается в последовательном использовании двух пар праймеров – внешней и внутренней. После использования первой пары праймеров продукт амплификации переносят в другую пробирку с внутренней парой праймеров. Иногда вместо «гнездной» амплификации используют процесс реамплификации. В этом случае проводят дополнительный раунд амплификации, в котором используют прежнюю пару праймеров, а в качестве ДНК-мишени – продукт первой реакции амплификации. Такая схема постановки амплификации более трудоемка и требует особенно тщательного обустройства лабораторных помещений, позволяющих гарантированно избегать контаминации продуктами реакции после использования внешней пары праймеров. К «гнездной» амплификации или реамплификации прибегают лишь в особых случаях, так как современные ПЦР-тест-системы позволяют добиваться тех же результатов иными средствами.

5 - увеличение продолжительности ПЦР до 40 циклов.

6 - применение более чувствительных методов детекции амплифицированной ДНК (компьютерная видеодетекция гельэлектрофореграмм; дот-гибридизация и использование меченных флуорохромами, лантаноидами, химическими веществами, вызывающими хемилюминесценцию, моноклональных антител).

Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории, это связано с наиболее острой проблемой метода – контаминацией.

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты. Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе электрофореза из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки.

Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отрицательными контролями.

Преимущества ПЦР:

1. Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК.

2. Тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно. Это преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-системы, которая составляет около 10 бактериальных клеток, в то время как чувствительность других тестов колеблется в пределах 103-106 клеток.

3. Тест-системы на основе ПЦР эффективны при диагностике трудно культивируемых, не культивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий. ПЦР-диагностикумы позволяют избежать основной трудности, связанной с неспособностью таких бактерий размножаться в лабораторных условиях. При ПЦР - диагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя.

4. ПЦР-диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность.

5. Определение можно проводить непосредственно в клиническом материале (кровь, сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы) и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва).

ПЦР длительное время являлась лишь качественным методом диагностики, но сегодня существует количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR). В этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

Устройство ПЦР-лаборатории.ПЦР-лаборатория должна быть разделена на три зоны по числу технологических операций:

1 - зона подготовки реакционной смеси («чистая зона»);

2 - зона пробоподготовки;

3 - электрофоретическая комната.

· Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха. Если первую и вторую зоны, в крайнем случае, допускается объединить (при наличии специальных боксов), то комната для электрофореза должна размещаться как можно дальше от двух других зон (другой этаж, другое здание) и иметь не связанную с другими зонами систему вентиляции. Это является одним из наиболее важных требований при организации ПЦР-лаборатории.

· Необходимо предусмотреть отдельные помещения для переодевания и хранения верхней одежды, приема пищи персоналом, складское помещение для лабораторных материалов.

· Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми УФ-лампами. Перемещение пробирок, штативов и прочего должно производиться только в одном направлении, при этом потоки не должны пересекаться.

· Клинический материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее обработан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с реакционной смесью из «чистой зоны» для внесения в них препаратов ДНК. После этого пробирки помещают в амплификатор и по окончании термоциклирования, не открывая крышек, переносят в комнату для электрофореза.

· В идеале все операции (пробоподготовка, подготовка реакционной смеси, электрофорез) должны выполнять разные люди.

При работе необходимо соблюдать такие же строгие меры предосторожности, как и используемые в микробиологической лаборатории.

· Для обработки клинических образцов должны быть установлены ламинарные шкафы, обеспечивающие вертикальный поток воздуха для безопасности персонала при работе с инфекционным материалом, а также предусматривающие возможность работы без ламинарного потока и длительное облучение внутренних поверхностей бокса УФ-светом.

· Инактивацию биологического материала проводят в автоклаве в течение 1 ч при 1,5 атм. Допускается использование настольных автоклавов.

· Запрещается внесение пробирок с положительными контролями или клиническими образцами как до, так и после обработки, в комнату подготовки реакционной смеси («чистую зону»).

· Все производственные комнаты должны быть снабжены необходимым оборудованием и расходными материалами, в том числе халатами, закрепленными за соответствующими помещениями.

Классическая ПЦР-лаборатория

А. Зона приема, регистрации и первичной обработки материала

Б. Зона выделения ДНК/РНК

В. Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР

Г. Зона детекции результатов ПЦР

Д. Зона дезинфекции материалов