Холерные вибрионы, биологические свойства(морфологические, культуральные, ферментативные, антигенные).

Холерный вибрион –грамотрицательная палочка в форме запятой. Спор и капсул не образует. Чрезвычайно подвижен за счет монотриха.

Культуральные св-ва:

· температура 37

· рН= 8.5-9

· требует наличия в среде 0,5% хлорида натрия.

Факультативный анаэроб. Но предпочитает аэробные условия роста. На жидкой пит. Среде образует пленку.

Среда накопления – 1%щелочная пептонная вода, на которой в течение 6-8 ч. Образует пленку.

Элективные среды – тиосульфат– цитратный, сахарозо – желчесодержащий агар. На них обр. колонии желтого цвета.

Б/х св-ва:

Обладает протеолитическими и сахаролитическими св-вами:

· продуцируют индол

· лизин декарбоксилазу

· разжижает в воронковидной форме желатин

· сероводород не продуцирует.

Ферментирует: глюкозу,сахарозу, маннозу, крахмал, лактозу.

Не сбраживает: рамнозу,арабинозу, инозит, инулин.

Чувствительность к фагу: классический вибрион – к бактериофагам IV группы, а эль-тор к фагу V группы.

Эль-тор вибрион гемолизирует эритроциты барана, аглютинирует куриные эритроциты.

Антигенные св-ва:

· О1 и О139 (серовары Огава, Инаба, Гикошима)

· Н- антиген.

Монофаги диагностические холерные жидкие, состав, назначение.

Диагностические жидкие холерные монофаги представляют собой МБП, предназначенные для дифференцировки классического холерного вибриона от эльтор. Данный МБП содержит холерный фаг С, который активен только в отношении классического холерного вибриона, или холерный фаг Эль – Тор, который активен только в отношении холерного вибриона эльтор.

Для постановки реакции в чашки разливают щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин при температуре 37 °С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5 - 0,7 %-го

питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45 °С, добавляют 0,1 - 0,2 мл бульонной культуры, тщательно смешивают и выливают на поверхность агара.

Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин. В центр квадратов наносят пастеровской пипеткой по капле монофагов в соответствующих разведениях. После подсыхания

капель чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре 37,0. Результаты учитывают через 3 - 4 и 18 - 20 ч. Наличие лизиса в виде одного «стерильного» пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Шигеллы. Патогенез дизентерии. Роль факторов инвазии, распространение.

Входные ворота – ротовая полость, где активируются факторы неспецифической защиты ( лизоцим, макрофаги, нейтрофилы)

Желудок: под действием соляной кислоты и ферментов честь гибнет, высвобождается эндотоксин.

Тонкая кишка: желчь часть шигелл разрушает, высвобождается эндотоксин, который обуславливает первые признаки заболевания – озноб и лихорадку.

Оставшиеся шигеллы проникают в дистальные отделы толстого кишечника, происходит адгезия их к слизистой кишечника, колонизация, отторжение ворсин кишечника в местах прикрепления, развитие воспаление. С помощью белков-инвазинов проникают в энтероциты, активно размножаются в них. Выделяют шигатоксин и шигаподобный токсины, которые нарушают обмен в-в (водно-солевой, углеводный и белковый). Разрушается эпителиальный покров кишечника, развитие катарально-язвенного воспаления.

Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов. Серодиагностика (РИФ, РПГА).

Антитела к возбудителям брюшного тифа и паратифов обнаруживаются в сыворотке крови больных с 8-10 дня заболевания.

РИФ:

Ингредиенты:

1)Сыворотка крови больного

2)Диагностикум

3)антиглобулиновые антитела, меченные флюорохромом.

АГ помещают на стекло и фиксируют. Наносят сыворотку больного. В результате взаимодействия АГ и АТ обр. иммунные комплексы. Затем АТ, непрореагировавшие с АГ диагностикума, смывают. Наносят антиглобулиновые антитела, меченные флюорохромом. Они взаимодействуют с обр. иммунными комплексами. Затем непрореагировавшие антиглобулиновые антитела, меченные флюорохромом, смывают. Образовавшиеся иммунные комплексы дают зеленое свечение в УФ- лучах люминесцентного микроскопа. Это положительная реакция. При отрицательной реакции , т.е. если не обр. иммунные комплексы, свечения не наблюдается.

РПГА. Ингредиенты:

1)ИХН ( во все лунки)

2)сыворотка крови больного

3) антигенный эритроцитарный диагностикум.

В 5 опытных лунках титруем сыворотку больного от 1:20 до 1:320.

2 контрольные лунки: контроль сыворотки и контроль диагностикума.

В опытные лунки добавляем одинаковое количество антигенного эритроцитарного диагностикума. В термостат.

Учет результатов:

«+» реакция – обр. зонтиков.

«-» реакция – обр. пуговок.

Лактобактерин сухой.

Содержание: Лактобактерин сухой представляет собой микробную массу живых, лиофилизированных в среде культивирования лактобактерий L. plantarum или L.fermentum.

Получение: клетки выращивают в достаточном объеме, отделяют от жидкой среды центрифугированием, суспендируют осадок в стерильном криопротекторе. Суспесию заливают в ампулы, замораживают в течение часа, затем подвергают лиофильной сушке.

Применение: предназначен для лечения детей и взрослых, страдающих:

•хроническими колитами различной этиологии, в том числе неспецифическими язвенными колитами;

•соматическими заболеваниями, осложненными дисбактериозами, возникшими в результате применения антибиотиков, сульфаниламидных препаратов и других причин;

•для лиц, перенесших острые кишечные инфекции, при наличии дисфункций кишечника или выделении патогенных и условно-патогенных бактерий;

•в акушерско-гинекологической практике для санации половых путей при неспецифических воспалительных заболеваниях гениталий и предродовой подготовке беременных группы "риска" с нарушениями чистоты вагинального секрета до III-IV степени.

Холерная вакцина.

Содержание: взвесь убитых холерных вибрионов

Получение: готовится из вибрионов Эль-Тори классических холерных вибрионов серотипов Инаба и Огава. Получают путем выращивания на искусственных питательных средах возбудителей холеры, которые затем подвергают инактивации, разрушению, выделению антигенных комплексов, очистке, конструированию в виде сухого или лиофильно высушенного препарата. В препарат обязательно добавляют консервант, иногда- адъюванты. Проводят контроль вакцины.

Применение: для активной иммунизации против холеры.

24.Возбудители дизентерии Зонне. Биологические свойства (морфологические, культуральные, ферментативные, антигенные, токсинообразование).

Дизентерия Зонне- анторпонозное инфекционное заболевание с преимущественным поражением толстой кишки и общей интоксикацией, вызываемое Shigella Sonnei. Вызывает шигеллез в легкой форме, часто в виде бактерионосительства.

Возбудитель: семейство : Enterobacteriaceae, род: Shigella, вид: S.Sonnei. (1 серовар).

Морфологические свойства: неподвижные (не имеют жгутиков) грамотрицательные палочки, размером 0.5-0.7*2-3 мкм. Спор и капсул не образуют. Многие имеют половые пили, а также снабжены фимбриями(для адгезии).

Культуральные свойства: хорошо растут на простых питательных средах. На плотных средах образуют мелкие гладкие блестящие полупрозрачные колонии, на жидких- диффузное помутнение. Образуют два типа колоний: S-формы (1 фаза) и R-формы (2 фаза).

Ферментативные (биохимические) свойства: S. Sonnei является наиболее биохимически активным видом, по биохимической активности подразделяется на хемовары. 1. Не образуют газ при ферментации глюкозы. 2. Способен ферментировать лактозу и сахарозу медленно, в течение 72 ч. 3. Не прдуцирует сероводород и индол 4. Ферментирует маннит.

Антигенные свойства: О-антиген, также обладает антгеном фазы 1, который является К-антигеном.

Токсинообразование: S. Sonnei продуцирует шигаподобные токсины- белковые токсины, состоящие из 1 субъединицы А- энзиматическая и 5 субъединиц В- рецепторные (имеют сродство к рецептору Gb3 на эндотелии капилляров). Субъединица А, проникнув в клетку, взаимодействует с субъединицей рибосом, необратимо блокируя синтез белка. Шигаподобные токсины накапливаются в периплазматическом пространстве и выделяются в окружающую среду после гибели шигелл. Эндотоксин защищает шигеллы от действия низких значений рН и желчи.

Бифидумбактерин сухой.

Содержание: содержит липофильно высушенную взвесь живых клеток B. Bifidum.

Получение: Биологическим агентом для получения бифидумбактерина является штамм Bifidobacterium bifidum № 1. Вначале получают культуру 1 поколения, затем 2 и 3 поколения (нативная взвесь) - выращивают чистую культуру бифидобактерий в биореакторе. По окончании процесса культивирования микробную взвесь с биореактора сливают в стерильные баллоны емкостью 16 л. Затем призводят лиофильную сушку.

Применение: лечение дизентерии и хронических кишечных инфекций невыясненной этиологии у детей. Применяется при дисбактериозах, пищевых токсикоинфекциях, синдроме мальабсорбции.

Колибактерин сухой.

Содержание: высушенные живые клетки Е. coli штамма М17, обладающего выраженными антагонистическими свойствами в отношении ряда кишечных патогенных бактерий

Получение: биологическим агентом для получения колибактерина является E.Coli.

Клетки выращивают в достаточном объеме, отделяют от жидкой среды центрифугированием, суспендируют осадок в стерильном криопротекторе. Суспесию заливают в ампулы, замораживают в течение часа, затем подвергают лиофильной сушке.

Применение: лечение дисбактериоза и дизентерии, главным образом у детей, при диарее (острой и хронической форме).

Холероген-анатоксин:

Содержание: взвесь убитых холерных вибрионов, выращенных в жидкой питательной среде. Препарат очищен от балластных веществ, выпускается в сухом виде.

Получение: Для получения препарата этот штамм (отличается от других штаммов стабильностью образования токсина), который хранится в высушенном виде в запаянных, ампулах, вначале подготавливают - тренируют путем пересевов на жидких и плотных питательных средах и лишь после этого, убедившись в полноценности его свойств, используют для посева на 250 л жидкой питательной среды, загруженной в реактор-культиватор, снабженный мешалкой. Выращивание в реакторе осуществляется в течение 10-11 часов при 34-37°С и постоянной аэрации подогретым до 30°С стерильным воздухом. С целью интенсификации токсинообразования осуществляется подкормка культуры заданными объемами 40% раствора глюкозы и 10% раствора аммиака в строго определенные сроки. После завершения цикла выращивания в бульонную культуру добавляют формалин до 0,6% концентрации для умерщвления вибрионов. Инактивация вибрионов наступает через 14-18 ч. Убедившись в полноте инактивации, бульонную взвесь вибрионов и их токсинов обрабатывают на суперцентрифуге со скоростью 8000 - 10 000 об/мин с последующим восполнением испарившегося формалина. Полученный формалинизированный безмикробный центрифугат собирают в бутыли и для полного обезвреживания токсина и О-антигена выдерживают при 10-12°С в течение 30-35 дней. После этого с помощью двукратного переосаждения сульфатом аммония в различных концентрациях в специальных реакторах вначале центрифугат освобождают от балластных фракций, а затем из раствора строго определенной оптической плотности высаливают необходимые антигены холерного вибриона, которые выпадают в осадок за 8-10 ч при 18-22°С. Полученный осадок отжимают на ультрацентрифуге, диализируют для освобождения от сульфата аммония и используют в качестве основы изготовления химической вакцины. Для этого взвесь антигенов разводят физиологическим раствором до концентрации белка, равной 5 мг/мл, стерилизуют фильтрованием через бактериальные свечи под вакуумом и разливают во флаконы или ампулы. Вакцину контролируют на:

физические свойства;

стерильность ;

токсичность;

холерогенность;

антигенную активность;

иммуногенность;

содержание О-антигена;

реактогенность для людей.

Применение: для специфической профилактики холеры.

Диагностика дисбактериоза.

Посевы изучают на наличие патогенных микроорганизмов и на нарушение соотношения различных видов микробов. Результаты исследования следует считать объективными при анализе роста изолированных колоний в том числе, если можно изучить морфологию и подсчитать количество колоний на чашку Петри. После идентификации проводят пересчет содержания микроорганизмов каждого вида на 1 г исследуемого материала. При обнаружении патогенной микрофлоры необходимо изучить ее чувствительность к антибактериальным препаратам и бактериофагам.

Отбор и доставка материала на дисбактериоз

Материалом для исследования является кал не позже 2 часов после дефекации.

Для получения достоверного результата стул должен быть обязательно утренним, самостоятельным, не на фоне лечения. У грудных детей забирать материал не с памперсов и пеленок.

Одну столовую ложку фекалий помещают в прокипяченную стеклянную баночку.

Лабораторная диагностика дисбактериоза кишечника

Метод исследования - бактериологический: мерный посев исследуемого материала с целью определения количества микроорганизмов наиболее значимых групп.

Этапы исследования:

•приготовление серийных разведений суспензии испражнений;

•посев на питательные среды из разведений;

•учет результатов посева и ориентировочная идентификация микроорганизмов;

•оценка результатов.

На первом этапе 1 грамм нативных фекалий растирают в ступке с 9 мл физ.растовора. из этого разведения делают посев на плотные питательные среды( среда Плоскирева или Левина). Одновременно делают массивный посев нативного кала на жидкие среды обогащения( Мюллера,селенитовая).Из основного разведения 1:10 делают дополнительные 100-кратные,затем вносят по 1 мл на среды( Эндо,Левина)и

0,01 мл на 3-5% кровяной агар. Для получения роста изоллированных ,доступных для счета колоний, применяют стеклянные бусы.Стерилизованные бусинки опускают в чашку с посевным материалом,при лёгком покачивании чашки с бусами в течении 1 мин материал равномерно распределяется по питательной среде.Посев бусами начинают с кровянного агара, затем бусы переносят на чашки с другими средами,все седы помещают в термостат(37 гр.,24 ч)

На втором этапе на среде Эндо посчитывают число и процент лактозонегативных бесцветных колоний (по отношению ко всему числу выросших колоний). Колонии со слабовыраженными ферментативными свойствами (слабое разложение лактозы-розовые колонии) подсчитывают по отношению к общему числу колоний. С чашек со средами (Эндо,Левина,Плоскирева ) выделяют не менее 4-5 колоний отличающихся по морфологии окраски. Пересевают на среды Реселла или на среду Олькеницкого, а так же в пробирку с бульоном, под пробку которой подвешена индикаторная бумажка для определения индола. В дальнейшем лактозонегативные культуры изучают прежде всего в отношении энтеробактерий(33 вопрос)

Рост микробов рода Протея характеризуется разложением мочевины и окрашиванием среду Ресселя фиолетово-коричневый цвет. Необходимо делать расчеты всех микроорганизмов, входящих в состав микрофлоры. Определить чувствительность к антибиотикам.