Ферменты генетической инженерии и особенности их использования для получения рекомбинантных ДНК

Методы генной инженерии

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

конструирование рекомбинантной ДНК;

гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Типы векторных систем

Векторные системы для клонирования, развитие - На основании изложенных выше черт различных поколений плазмидных векторов для молекулярного клонирования (включая фрагмидные) можно составить

Схема развития плазмидных векторов

весьма упрощенную схему, позволяющую в то же время проследить особенности развития векторных систем общего назначения (рис.).

Так, векторы для молекулярного клонирования первого поколения представляют собой естественные бактериальные плазмиды так называемого дикого типа, обнаруженные ранее в клетках кишечной палочки Escherichia coli как экстрахромосомальные элементы. Плазмида pSC101, характеризующаяся большим размером, низкой копийностью и естественным расположением сайтов узнавания всех рестрикционных эндонуклеаз, была одним из таких векторов, который широко использовался в те первые годы молекулярного клонирования. Ее возможности как векторной молекулы были сильно ограничены и поэтому шло конструирование новых плазмид, обладающих целым рядом преимуществ.

Ко второму поколению векторов следует отнести уже искусственно созданные плазмиды, объединившие в себе черты различных природных плазмид дикого типа. Их наиболее ярким представителем явился плазмидный вектор pBR322, вобравший в себя такие черты своих предшественников, как репликон рМВ1, ген устойчивости к тетрациклину TcR и ген устойчивости к ампициллину ApS. За счет ослабленного контроля репликации копийность плазмиды pBR322 составила уже около 20-50 копий на клетку. Единственное, что осталось неизменным по отношению к первому поколению векторов, как это то же самое естественное расположение сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции. Плазмида pBR322 оказалась достаточно удобным вектором для молекулярного клонирования и многие ее черты легли в основу третьего поколения плазмидных векторов. Так, от pBR322 к ним перешли репликон ColEl и маркерный ген устойчивости к амплициллину. Размер самой векторной молекулы, впрочем, еще уменьшился, главным образом, за счет удаления гена устойчивости к тетрациклину. Копийность на бактериальную клетку возросла и достигла 200 копий. Однако главными новыми чертами этих плазмидных векторов можно считать маркерный ген, кодирующий NH2-концевой фрагмент β-галактозидазы LacZ' и встроенный в него искусственно созданный полилинкер, а также то, что в остальной последовательности вектора были удалены сайты узнавания некоторых рестрикционных эндонуклеаз с гексануклеотидными сайтами узнавания.

Следующее поколение плазмидных векторов, первыми представителями которого являются плазмиды pSP64 и pSP65, считать отдельным поколением несколько трудно по причине не очень значительного усовершенствования векторов предыдущего поколения, на основе которых они и были сконструированы. Однако тот факт, что практически все векторы общего назначения следующих поколений также содержат эти небольшие участки промоторных областей бактериофагов SP6, ТЗ или Т7, то их все же можно отнести к четвертому поколению.

Векторы пятого поколения, сохранив главные черты своих предшественников, весьма сильно отличаются от них, поскольку представляют собой гибридные конструкции, содержащие, кроме плазмидных последовательностей, межгенный участок одноцепочечного нитевидного фага f1, ответственный за репликацию фага. Такие химерные векторы, получившие название фагмид, содержали сразу два участка инициации репликации f1 и ColE1. Одной из первых широко применявшихся фрагмид были вектора семейства pEMBL, созданные на основе векторов pUC8/pUC9 и межгенного участка одноцепочечного фага f1.

Шестое поколение векторов, первым представителем которого является вектор pSequoiaT12, отличается от своих предшественников только тем, что в его нуклеотидной последовательности нарушены сайты узнавания для одной или нескольких частощепящих тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. Так, первые два поколения плазмидных векторов имели естественное расположение сайтов узнавания как гексануклеотидных, так и тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. У всех последующих поколений векторов, начиная с третьего, кроме прочих преимуществ, появился также искусственно созданный полилинкер, в котором были сосредоточены сайты узнавания нескольких гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз. Однако для его эффективного использования было необходимо нарушить имевшиеся сайты узнавания этих ферментов в остальной последовательности вектора. Поэтому для векторов третьего поколения в отличие от своих предшетвенников уже не характерно естественное расположение сайтов узнавания некоторых ключевых (полилинкерных) гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз в самой последовательности вектора. Однако, можно считать, что все ранее созданные векторы предыдущих поколений все же имели весьма существенный недостаток в виде наличия в их векторной последовательности сайтов узнавания для частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными участками узнавания, ввиду чего было невозможно расщеплять вставку этими ферментами, поскольку это неминуемо привело бы к разрушению вектора. Уникальной чертой векторов pSequoia является отсутствие в их нуклеотидной последовательности сайтов узнавания для некоторых частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными участками узнавания. Создание плазмидных векторов с отсутствием в них сайтов тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз значительно уступает по своей значимости созданию, например, фагмидных векторов. Однако то, что данная черта в виде отсутствия сайтов узнавания для отдельных тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, несомненно, будет присуща последующим поколениям плазмидных векторов общего назначения, позволяет считать семейство векторов pSequoia новым, шестым поколением плазмидных векторов.