Эпигентическая изменчивость – особенности и значение

Явление рестрикции и модификации и значение в генной инженерии. Экзо и эндонуклепзы. Номенклатура рестриктаз.Система рестрикции-модификации - ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция- защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности - метилтрансферазная (метилазная) и эндонуклеазная. За каждую из них могут отвечать как отдельные белки, так и один белок, сочетающий в себе обе функции. Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. Экзонуклеазы — белки из группы нуклеаз, отщепляющие концевые мононуклеотиды от полинуклеотидной цепи путём гидролиза фосфодиэфирных связей между нуклеотидами. В зависимости от способности гидролизовать связи на 3' и 5' концах полинуклеотидной цепи различают 3' и 5' экзонуклеазы. В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую следующие пункты:

1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco 2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B. 3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae). 4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III).

46. Как можно получить растения, устойчивые к абиотическим факторам окружающей среды с помощью биотехнологических меодов? Приведите примеры

Культура растительных клеток и тканей представляет собой биологическую систему, в которой отсутствуют регуляторные механизмы, действующие на уровне целого организма. Исследования, проведенные на однородном клеточном материале, наряду с пониманием иерархии систем регуляции физиологических процессов позволяют получить более определенные результаты по анализу действия абиотических и биотических стрессовых факторов на растительную клетку. Это отвечает требованиям современного селекционного процесса, где неотъемлемым элементом является повышение устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды.

Традиционная селекция ведется на уровне организмов, но процесс эффективно ускоряется при использовании тканевых и клеточных культур.

В условиях in vitro можно задавать различные параметры, адекватные тем, в каких позже придется жить взрослым растениям, в том числе и экстремальные условия выращивания. В культивируемых in vitro клеточных популяциях обнаружена тенденция к высокой наследственной изменчивости качественных и количественных свойств клеток.

Особый интерес у исследователей вызывают работы по получению растений-регенерантов из каллусных и суспензионных культур, прошедших отбор в стрессовых условиях.

Отбор на селективных средах может быть прямой и непрямой. Прямая селекция заключается в том, что в питательную среду добавляют в качестве селективных агентов факторы, к которым необходимо получить устойчивые линии, - повышенное содержание солей - NaCl, Na2SO4, AlCl3, K2SO4; водный стресс, отсутствие O2; продукты метаболизма фитопатогенов и т.д. Непрямая селекция заключается в получении растений, синтезирующих защитные соединения при этих стрессовых факторах.

Предложена следующая схема получения устойчивых линий клеточных культур: воздействие стрессора на культуру клеток будет приводить к частичной гибели популяции, но часть клеток может выжить, причем тем меньшая часть, чем сильнее стрессовое действие. Выжившие клетки переносят на свежую питательную среду, и культура будет толерантной к этому стрессору.

Использование токсинов фитопатогенов в отборе форм растений, устойчивых к болезням

Традиционных методов селекции недостаточно, чтобы улучшить генофонд растений в направлении устойчивости к наиболее опасным патогенам; требуются новые подходы, которые в сочетании с классическими методами позволили бы добиваться дальнейших успехов в создании новых устойчивых к биотическим стрессам, особенно к болезням, сортов сельскохозяйственных культур. Один из таких подходов - использование клеток и тканей растений для создания исходного для селекции на устойчивость к инфекционному стрессу материала. Имеется много примеров реализации таких подходов.

Клеточную селекцию моркови проводили с использованием культурального фильтрата гриба Alternaria radicina, для чего применяли различные схемы селекции. Для формирования растений проростки переносили в пробирки на жидкую и агаризованную питательные среды. Растения-регенеранты контрольного варианта и полученные после клеточной селекции были проверены на устойчивость к патогену A. radicina. Для этого растения из пробирок были помещены на питательную среду, содержащую 95 %-й культуральный фильтрат гриба. Растения, полученные после клеточной селекции, обладали повышенной устойчивостью к метаболитам гриба А. radicina.

К настоящему времени созданы линии картофеля, томатов, пшеницы, моркови, риса, устойчивые, соответственно, к фитофторозу, альтернариозу, септориозу, ирукуляриозу и т.д., где в качестве селективного фактора используется культуральный фильтрат гриба.

Особую актуальность приобретают научные работы, посвященные селекции на устойчивость к корневым гнилям зерновых, из-за широкого распространения и высокой вредоносности данной болезни. В отборе форм ярового ячменя, устойчивых к корневым гнилям и перспективных для селекции на устойчивость к данному заболеванию в условиях Восточной Сибири, использовано однократное добавление токсических метаболитов корневых гнилей (20 %) в селективные среды на стадии пролиферации каллусных тканей. Выжившие каллусы обладали способностью к стеблегенезу и ризогенезу. Полученные на их основе растения регенеранты в своем большинстве отличались устойчивостью к поражению возбудителями корневой гнили.

Выделение солеустойчивых форм растений путем прямой и непрямой селекции в культуре ткани

Одним из факторов внешней среды, которые приводят к значительному снижению урожайности многих сельскохозяйственных культур, является засоленность почв. В связи с общим ухудшением экологической обстановки в мире и широким применением искусственного орошения возрастает потребность в селекции солетолерантных форм растений.

В частности, такая проблема весьма актуальна и для районов рисосеяния. Скрининг уже имеющихся в местных сортах и популяциях вариантов дает положительные результаты, но существует необходимость дальнейшего повышения солеустойчивости риса, которая в целом значительно ниже, чем у других зерновых, например пшеницы и ячменя.

Механизмы солетолерантности еще недостаточно изучены, несмотря на большое количество исследований. Затрудняет селекцию солетолерантных растений и значительная вариабельность типов засоленности. Большие возможности для изучения стрессоустойчивости (в том числе и солеустойчивости) дает применение культуры растительных клеток. Как правило, при прямом отборе солетолерантных клеточных линий используют питательные среды, содержащие в качестве селективных агентов какую-либо соль.

У ряда культур уже получены путем прямой селекции клеточные линии и растения-регенеранты, обладающие свойством солеустойчивости и сохраняющие его при регенерации и семенном размножении. Кроме прямого отбора возможны и непрямые методы селекции на устойчивость к стрессам (в том числе и к засолению). Хорошо известна, например, защитная роль пролина при воздействии на бактериальные и растительные клетки ряда неблагоприятных факторов внешней среды: холодового и теплового шока, водного стресса, повышенного содержания солей и др. В связи с этим представляет интерес получение клеточных линий растений, способных в ответ на стрессовые воздействия накапливать значительные количества пролина, обеспечивая таким образом неспецифическую защиту организма.

Процесс селекции устойчивых вариантов в культуре тканей растений обычно состоит из двух основных этапов: собственно отбора устойчивых клеточных линий на соответствующих селективных средах и регенерации растений из полученных клеточных вариантов.

Путем прямой селекции на среде, содержащей 1 % хлористого натрия, получена серия регенерантов. Для проведения селекции стрессоустойчивых вариантов риса непрямым путем, т.е. путем отбора устойчивых к аналогам пролина клеточных линий с последующей регенерацией растений, была изучена чувствительность каллусных культур риса дикого типа к двум его аналогам. При этом обнаружена чрезвычайно высокая устойчивость исходных каллусных линий риса к обоим аналогам.

Удалось получить солетолерантные каллусные линии и растения риса путем прямой (отбор и регенерация на NaCl-содержащих средах) и непрямой (на средах с аналогами пролина) селекции в культуре ткани нескольких сортов риса, несмотря на обнаруженную чрезвычайно высокую естественную устойчивость каллусной культуры риса к аналогам пролина.

В Красноярском НИИСХ разработаны технологии создания регенерантов ячменя в культуре незрелых зародышей с использованием стадии каллусных тканей и селективных сред (высокие концентрации соли и низкие рН) и получены десятки линий-регенерантов, у которых подтверждена устойчивость к засолению и кислотности почв.

Однако применение селекции позволяет получать клеточные линии и растения, обладающие защитой от солевого стресса. Особенно перспективен этот подход к сортам, имеющим низкую солеустойчивость, так как такой метод повышает общую неспецифическую защиту клетки и значительно увеличивает ее устойчивость стрессам организма.

Одним из методов получения мутантов с повышенным синтезом аминокислот является отбор вариантов, устойчивых к соответствующим аналогам. Ранее путем селекции на устойчивость к одному из аналогов пролина -L-азетидин-2 карбоновой кислоте - были получены солетолерантные клеточные линии табака и сои. Выделенные регенеранты отвечали повышенным синтезом пролина при помещении в среды с NaCl и обладали повышенной осмостойкостью.

Другим аналогом пролина является L-оксипролин, который также позволяет получить солеустойчивые растения.

Выработка у растений солеустойчивости важна не только в сельском хозяйстве, но и хозяйстве городском. Применение противогололедных реагентов, в частности, технической соли, на улицах городов неблагоприятно для роста и развития растений. Используя культуру in vitro на селективных средах можно в течение короткого времени провести скрининг больших популяций клеток овсяницы и полевицы - основных газонных трав на признак солеустойчивости. Отмечается наследование толерантности к NaCl и перекрестная устойчивость к бишофиту (MgCl2) - основной противогололедной соли.

Также применяются новые селективные среды с ионами Ва2+ для отбора солеустойчивых клеточных линий.

Отбор холодоустойчивых форм

В настоящее время актуальной проблемой является повышение устойчивости теплолюбивых растений к действию пониженных положительных температур (холодоустойчивости). Известно много работ, в которых показано повышение холодоустойчивости посредством химических или физических воздействий. Однако имеются лишь единичные работы, использующие методы и технологии in vitro в целях получения холодоустойчивых форм теплолюбивых растений.

В условиях in vitro можно задавать различные параметры, адекватные тем, в каких позже придется жить растениям, в том числе и экстремальные условия выращивания, например пониженные температуры. Это также одна из реальных задач в сельском хозяйстве, так как ее решение позволит успешно культивировать растения в районах с частыми весенними заморозками. Таким способом созданы более холодоустойчивые линии табака, риса, томата.

Каллусные культуры получали из различных частей стерильных этиолированных растений огурца. Холодовое повреждение (жизнеспособность) клеток каллусных тканей определяли по восстановлению трифенилтетразолия хлорида, по прижизненному окрашиванию метиленовым синим с последующим подсчетом числа живых и мертвых клеток в гемоцитометре (камере Фукса - Розенталя) и по приросту каллусной ткани в течение 10 дней после охлаждения.

В качестве критерия жизнеспособности растительных клеток использовали состояние их митохондрий, оцениваемое по восстановлению ТТХ. Из каллусов первого пассажа, выдержанных в течение 24 ч при оптимальной (25 °С) и пониженной (3 °С) температуре, экстрагировали продукт восстановления ТТХ - формазан. Поскольку различные органы теплолюбивых растений обладают неодинаковой холодовой чувствительностью, предполагали, что и каллусные линии, полученные из этих органов и сохраняющие эпигенетические особенности, различаются по чувствительности к охлаждению.

Для оценки соотношения живых и мертвых клеток в клеточных культурах использовали также прижизненное окрашивание красителями с последующим подсчетом окрашенных и неокрашенных клеток.

Способность растительных клеток переносить действие стресса отражается в образовании новой каллусной ткани после переноса в оптимальные условия. Через 10 сут после сублетального охлаждения (3 °С, 24 ч) каллусов первого пассажа измеряли параметры роста линий различного происхождения. Каллусы, полученные из семядольных листьев, показали наибольший прирост линейных размеров. Наименьший прирост к исходному размеру наблюдали у охлажденных каллусных линий, полученных из гипокотиля. Это, вероятно, также связано с эпигенетическими особенностями клеток культур.

Измерения чувствительности к охлаждению каллусных линий в I-IV пассажах позволили выявить тенденцию к постепенному повышению холодоустойчивости. В результате систематически действующего стрессового фактора происходит адаптация клеточных культур к пониженным температурам и повышение жизнеспособности клеток после стрессового воздействия.

Все исследованные факторы (различные экспланты и условия выращивания) оказывают существенное влияние на холодоустойчивость каллусных линий.

Сравнивая устойчивость каллусов различного происхождения, можно заключить, что наиболее устойчивыми к пониженным температурам являются каллусные линии, полученные из семядольных листьев и апикальной зоны побега.