Тема: Возбудители эшерихиозов. Колибактериоз.

Цель занятия. Усвоить правила отбора и пересылки патологического материала в лабораторию, а также освоить методику проведения бактериологического иссле­дования патматериала.

Задание:

1. Сделать посев взвеси бактерий из пробирок на МПБ по 2 пробирки, МПА, МПЖ, среда

Левина, агар Эндо.

2. На засеянных пробирках и чашках Петри поставить № исходной куль­туры и поставить

в термостат.

3. Приготовить мазки из исходной культуры, окрасить по Граму, микроскопировать и

зарисовать.

Материалы и оборудование. Пробирки со взвесью микробных культур, обозна­ченных цифрой (шифр),— бактерий Е. coli и Salmonella; питательные среды — МПБ, МПА, МПЖ в пробирках, среды с лактозой, глюкозой и индикатором, агар Эндо и агар Левина в чашках Петри, кровяной агар, пастеровские пипетки, реактивные бумажки для определения индола, среда с сернокислым железом для определения сероводорода.

Для демонстрации: таблица-схема хода исследования пат.материала на колибактериоз, а также биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 5, грамотрицательные факультативные анаэробы.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Enterobacteriaceae;

Род – Escherichia;

Вид – Escherichia coli (животные и человек), E.blatta (насекомые).

Возбудитель эшерихиозов (колибактериоза, отечной болезни свиней) - Е. coli (кишечная палочка). Колибактериоз - это остропротекающее инфекционное заразное заболевание молодняка разных видов животных (включая птиц и пуш­ных зверей). Характеризуется, как правило, диареей (профузным поносом), обез­воживанием организма, депрессией, нарастающей слабостью и смертельным ис­ходом. Колибактериоз протекает в трех формах: септической, энтеротоксемической и энтеритной. При последних двух формах сепсис отсутствует. Телята вос­приимчивы в первые часы и дни после рождения; поросята заболевают как в пе­риод новорожденности, так и после отъема. Кроме того, у поросят встречается еще одна форма эшерихиоза — отечная болезнь. Ягнята заболевают с первых дней после рождения до 5—6-месячного возраста. Птица поражается в основном в первые 2 - 4 месяца Взрослые животные колибактериозом не болеют, но явля­ются бактерионосителями патогенных штаммов Е.coli. Кишечная палочка может быть также возбудителем эндометрита и мастита у коров.

Патологический материал. Для бактериологического исследования прижизненно в лабораторию направляют фекалии от больных животных. Для посмертной диагностики: свежий труп или трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, сердце у аорты, перевязанное лигатурой, брыжеечные лимфоузлы, отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанного с двух сторон (упаковка отдельно от остального материала).

В лаборатории при вскрытии трупа теленка (поросенка, ягненка), помимо указанного материала, исследуют еще и головной мозг. Трупы (целиком) направ­ляют в лабораторию в водонепроницаемой таре. Если не представляется возмож­ным доставить материал в кратчайший срок (4 часа), его консервируют (кусочки органов) стерильным 30 %-ным водным раствором глицерина или 10 %-ным рас­твором NaCl. В лаборатории материал исследуют соблюдая правила асептики: проводят посевы на питательные среды — МПБ, МПА, среды Эндо или Левина. В пробирки со средами посевы проводят пастеровскими пипетками (2—3 капли), а на плотные питательные среды в чашках Петри материал наносят шпателем. Кроме того, посевы из печени, почки, лимфоузлов, селезенки и головного мозга осуществляют методом отпечатков на поверхности агара в чашках (Эндо и др.). Для этого, придерживая стерильным пинцетом, стерильными ножницами выре­зают кусочек ткани, фламбируют его и разрезанной поверхностью касаются по­верхности среды. Посевы помещают в термостат. После посевов из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки из пе­чени, селезенки, крови из сердца, фиксируют и окрашивают по Граму.

Микроскопия. Определяют морфологические и тинкториальные свойства. На препаратах «висячая капля» устанавливают подвижность (или ее отсутствие) у бактерий. Чаще Е. coli — подвижный микроб (перитрих), но встречаются и не­подвижные варианты. Форма его палочковидная с закругленными концами, ок­рашивается грамотрицательно (розово-красный цвет),- споры не образует; длина микробной клетки 1—3 мкм, ширина — 0,8 мкм. Располагаются бактерии оди­ночно. Капсулу не образует, за исключением отдельных штаммов серогрупп 08, 09,0101.

Рис.12 Кишечная палочка. Окраска по Граму.

После инкубирования засеянных пробирок и чашек Петри в термостате вы­росшие культуры бактерий вновь просматривают под микроскопом. Типичные колонии на средах Эндо (или Левина) пересевают для получения чистой культу­ры в пробирках с МПБ и МПА. Полученную чистую культуру пересевают на специальные дифференциально-диагностические среды для определения биохимических и антигенных свойств возбудителя колибактериоза (посредством РА), а также его патогенности (биопробой).

Культуральные свойства. Е.coli хорошо растет на всех широко используе­мых в лабораторной практике питательных средах. Оптимальная температура роста 37—38⁰С, рН среды 7,0—7,2. По типу дыхания — аэроб (и факульта­тивный анаэроб). В жидкой среде рост эшерихий проявляется в виде равномерно­го помутнения среды с образованием легко разбивающегося осадка. На МПА че­рез 16—20 ч вырастают влажные, круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью, серовато-белого цвета. Существуют штаммы Е.coli, обладающие гемолитическими свойствами (вокруг колонии на кровяном агаре проявляется зона гемолиза). Для установления родовой и видовой принадлежности культур большое значение имеет выявление биохимических свойств. С этой целью чистую культу­ру высевают на ряд специальных сред. На среде Эндо в чашках Петри Е.coli образует 2 типа колоний: темно-вишневого цвета с металлическим блеском и малиново-красные с розовым ободком. На среде Левина колонии темно-фиолетовые или черные.

Ферментные (биохимические) свойства. Это объясняется тем, что кишечная палочка сбраживает лактозу, содержащуюся в среде, при этом образуется молочная кислота, под действием которой происходит восстановление цвета фуксина, также входящего в состав среды, но обесцвеченного сульфитом натрия. Глюкозные и лактозные среды с индикатором Е. coli сбражива­ет, и среда в пробирках становится розового или красного цвета. Встречаются лактозонегативные штаммы (сероварианты) Е. coli, не сбраживающие лактозу. Многие штаммы ферментируют маннит, дульцит. Е. coli образует индол, не образует H₂S, дает положительную реакцию с метиловым красным (среда окрашивается в розо­во-красный цвет) и отрицательную реакцию Фогеса — Проскауэра (среда окра­шивается в желтый цвет). Последние две пробы ставят с двухсуточной культу­рой, выращенной на среде Кларка (раствор пептона, глюкозы, двухфосфорнокислого калия в дистиллированной воде). В пробирку с культурой на среде Кларка пипеткой добавляют 5 капель спиртового раствора метилового красного, пробир­ку встряхивают. При ферментации глюкозы происходит розовое окрашивание, при отсутствии ферментации углевода — желтое окрашивание, отрицательный результат. В другой пробирке с культурой на среде Кларка проводят пробу Фогеса — Проскауэра: добавляют 0,2 мл 40 %-ного КОН и 0,5 мл 6 %-ного спиртового раствора альфа-нафтола, учитывают результат через 3—5 минут. Если культура сбраживает глюкозу с образованием ацетилметилкарбинола, последний с инди­катором дает розовое окрашивание, положительный результат. На жидкой синте­тической среде Козера и плотной среде Симмонса с индикатором бромтимолблау Е. coli не растет потому, что не усваивает цитратно-аммонийные соли сред. Е. coli желатину не разжижает, мочевину не расщепляет.

Родовую дифференциацию семейства Enterobacteriaceae проводят на основе культурально-морфологических и биохимических свойств бактерий. Учитывая, что биологические свойства разных штаммов эшерихий неодинаковы, в связи с их различной вирулентностью и антигенной структурой выделенную из иссле­дуемого материала чистую культуру подвергают серологической типизации в РА, используя набор типоспецифических агглютинирующих 0-колисывороток.

Антигенное строение Е. coli. Клетка содержит три вида антигенов: О — соматический, К— оболочечный, капсульный и Н— жгутиковый. О-антиген термостабильный, расположен в клеточной стенке, состоит из липидо-полисахаридо-протеинового комплекса. К-антиген- это кислый полисахарид, реже протеины. Н-антиген- белковой природы, термолабильный.

Патогенность Е. coil (при проведении бактериологической диагностики) определяют внутрибрюшинным заражением молодых белых мышей массой 13— 15 г. Хотя белые мыши малочувствительны к Е. coli, но в большинстве случаев эти микробы, выделенные из органов трупов (или из фекалий) больных колиинфекцией животных, патогенны для мышей. Е. coli, выделенные от здоровых животных (и людей), обычно непатогенны. Патогенность для белых мышей зави­сит от вирулентности штамма, дозы вводимых бактерий, веса (возраста) мышей, метода заражения и индивидуальной иммунологической реактивности, а также от условий кормления и содержания.

Характеризуя биологические свойства Е. coli, следует отметить, что у пато­генных штаммов отмечается продуцирование двух типов токсинов — термола­бильного экзотоксина и термостабильного эндотоксина. Имеются штаммы Е. coli (как патогенные, так и непатогенные), продуцирующие антибиотические вещест­ва — колицины, подавляющие рост некоторых других штаммов эшерихий и не действующие на бактерий других видов. Колицины термостабильны.

Помимо общепринятого метода микробиологической диагностики, исполь­зуют и некоторые дополнительные ускоренные методы:

- реакция нейтрализации антител (РН),

- реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), позволяющая обнаружить возбудителя болезни в фекалиях больных жи­вотных.

- люминесцентная серодиагностика – используют как ориентировочный метод для определения патогенных серотипов кишечной палочки при массовых вспышках желудочно-кишечных заболеваний. Этот метод позволяет в кратчайшие сроки получить предварительный результат.

- фагодиагностика.

- ИФА.

- ПЦР.

- иммунохроматографический анализ.

Контрольные вопросы:

1. Патологический материал для бактериологической диагностики колибактерио­за.

2. Морфология, тинкториальные и культурально-биохимические свойства Е. coli

3. Дифференциально-диагностические среды, применяемые для выделения и

идентификации Е. coli.

4. Патогенность Е. coli для лабораторных животных.