Раздел 1 Частная микробиология

Тема: Патогенные стафилококки

Цель занятия: Усвоить, какой патологический материал при разных гнойно-воспалительных процессах надлежит направлять в лабораторию. Ознакомиться с питательными средами, методами выделения и культивирования стафилококков, а также с методами дифференциации патогенных и непатогенных стафилококков.

Задание:

1. Сделать посев исследуемого материала на питательные среды;

2. Приготовить мазок и окрасить по Грамму;

3. Провести микроскопию мазков;

4. Результаты зарисовать в тетради.

Материалы и оборудование: Воспалительный экссудат (гной) от больного жи­вотного (из клиники или учебно-опытного хозяйства); пробы молока от коров больных маститом; питательные среды: МПБ, МПА, селективная среда — соле­вой, кровяной МПА (для выделения стафилококков), глюкозно-сывороточный МПБ; пастеровские пипетки. Для демонстрации: таблица-схема «Порядок бакте­риологического исследования при стафилококкозах».

Классификация (по Д.Берджи):

Отдел – Firmicutes

Секция –12,грамположительные кокки.

Класс - Schizomycetes

Порядок – Eubacteriales

Семейство – Micrococcaceae

Род – Staphylococcus.

Виды – St.aureus, St.epidermidis haemoliticus,

St.saprophyticus.

Рис.1 Электронная микроскопия стафилококка

Стафилококки– широко распространенные в природе микроорганизмы шаровидной формы, большинство из них сапрофиты. По современной классификации известно уже 27 видов, при этом 14 видов обнаружены на коже и слизистых оболочках человека и животных. Большинство стафилококков абсолютно безвредны. Практиче­ский интерес представляют патогенные (гемолитические) кокки, и их дифференциация от

непатогенных видов стафилококков.

Стафилококкозы у животных (и человека) характери­зуются многообразием клинических проявлений - абсцессы, флегмоны, фурунку­лы, маститы коров, эндометриты, пневмонии, менингиты, в ряде случаев пиемия и сепсис со смертельным исходом. Патогенные штаммы стафилококков могут быть причиной пищевых токсикоинфекций у людей. Они обитают на коже и слизистых оболочках дыхательных, пищеварительных и мочевыводящих путей. Сапрофитные стафилококки, обладающие гнилостными свойствами, вызывают порчу сырья и пищевых продуктов.

Инфекционные процессы, обусловленные стафилококками и стрептококка­ми, как правило, сопровождаются образованием гноя, поэтому патогенные кокки иногда называют гноеродными.

К стафилококкам чувствительны лошади, крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, утки, гуси, индейки, куры.

Материал для бак. исследования: Для правильного отбора пато­логического материала, направляемого в лабораторию с диагностической целью, всегда учитывают характер течения инфекционного процесса. Патологическим материалом при стафилококкозах является раневой экссу­дат, гной, содержимое язв, карбункулов, при мастите - пробы молока от коров. При открытых раневых поверхно­стях или обширных флегмонах раневой экссудат (отделение) берут стерильным ватным тампоном, свернутым на одном конце тонкой выструганной палочки. Дру­гой конец палочки вмонтирован в ватную пробку и вставлен в пробирку. Пробирки с такими тампонами завертывают в бумагу по 10-15 штук и стерилизуют. При взя­тии пробы материала пробирку открывают, тампон вынимают (за палочку); пропи­тывают гноем и вновь вставляют в пробирку и упаковывают для отправки в лабора­торию. Жидкий экссудат можно отсосать стерильной пипеткой или иглой со шпри­цом и слить в стерильную пробирку. Если абсцесс не вскрыт, скопившийся в нем экссудат (гной) берут асептически: поверхность абсцесса дезинфицируют, затем делают прокол с стерильной иглой на стерилизованном шприце и содержимое выливают в стерильную пробирку, закрывают пробкой, помещают в железный или деревянный футляр (пенал) для отправки в лабораторию. Материал, поступивший в лабораторию подвергают нескольким исследованиям.

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯвключает: микроскопию препаратов-мазков, посев на питательные среды и выделение чистой культуры стафилококка, определение ее патогенности, антибиотикорезистентности и биопроба.

Микроскопия. Предварительно делают посевы патологического материала на питательные среды, затем готовят мазки: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят (растирают) бактериологической пет­лей каплю гноя. Мазки после высушивания на воздухе фиксируют, окрашивают по Граму, микроскопируют. Характерным для стафилококков является шаровид­ная форма клеток (диаметр 0,7—1,0 мкм), располагающихся обычно различными скоплениями. Но иногда в гное наряду со скоплениями кокков (в виде гроздьев) обнаруживают отдельные или парные клетки или короткие цепочки кокков по 2—4 клетки. Размеры кокков колеблются (сапрофиты значительно крупнее—2— 4 мкм). Стафилококки окрашиваются грамположительно, споры и капсулы не об­разуют, неподвижные. При микроскопии можно обнаружить как большие шаро­видные L-формы, так и очень мелкие G-формы. Наблюдают их в мазках из куль­тур стафилококков, подвергавшихся воздействию различных факторов (фи­зических, химических, биологических). Если материал поступил от животных, больных ботриомикозом (обычно лошадей, редко крупного рогатого скота, сви­ней), то в слизисто-гнойном содержимом очагов обнаруживают зооглеи — зооглейные скопления кокков, окруженных общей гомогенной капсулой.

Культивирование и культуральные свойства. Для выделения стафилокок­ков из исследуемого материала пастеровской пипеткой насасывают небольшое количество гноя и по 1—2 капли наносят на питательные среды. Если гной гус­той, его разводят стерильным физ.раствором, затем засевают. Стафилококки к питательным средам неприхотливы, хорошо растут на общеупотребительных сре­дах — МПБ, МПА, МПЖ, рН 7,2—7,4. Оптимальная температура роста 35-37°С, но мо­гут расти в пределах 10-45°С. Аэробы, факультативные анаэробы. При исследовании патологического мате­риала для посева необходимо пользоваться селективной средой — солевой кро­вяной МПА (МПА с 8—10 % NaCl и 5 % дефибринированной крови). Примене­ние этой среды основано на способности стафилококка выдерживать высокие концентрации NaCl (до 16 %). Другие виды микроорганизмов в этих условиях не растут. Помимо селективной среды, используют МПА с кровью (в чашках Пет­ри), молочно-солевой агар, МПА с добавлением 40% желчи. Чистую культуру стафилококка можно получить после посева исследуемого материала на 5%-ный кровяной агар.

Культуральные свойства характеризуются обильным помутнением МПБ и осадком. Возможно появление серовато-белого пристеночного кольца или плен­ки. На плотных средах (МПА) через 12—24 ч инкубирования в термостате вы­растают круглые сочные непрозрачные колонии в диаметре 2—4 мм. Цвет их за­висит от вида стафилококка и вырабатываемого им пигмента (буровато-белый, золотистый или кремовый, лимонно-желтый). На кровяном агаре большинство патогенных видов стафилококков образуют зону гемолиза вокруг колонии. Изо­лированную колонию с солевого или кровяного МПА пересевают в пробирки со скошенным МПА или в МПБ; выросшую чистую культуру идентифицируют. В МПЖ через 24-26 ч отмечается обильный рост по уколу и разжижение среды, которое затем увеличивается.

Ферментативные (биохимические) свойства стафилококков — их определе­ние имеет особое диагностическое значение. Чистую культуру засевают в молоко, среды с углеводами, МПЖ (или свернутую лошадиную сыворотку). Стафилококки обладают протеолитическими свойствами: МПЖ (в пробирке столбиком) разжижа­ется к пятому дню, также медленно разжижается свернутая кровяная сыворотка; молоко свертывается, затем образовавшийся сгусток казеина пептонизируется. Индол не образует. Восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют каталазу, уреазу. Из углеводов ферментируют (расщепляют) лактозу, глюкозу, глицерин, са­харозу, мальтозу, маннит. Ферментация маннита рассматривается как свойство патогенных видов стафилококков.

При определении па­тогенных ста­филококков учитывают следующие биохимических свойств:

- определяют ДНК-азную активность (выявление фермента ДНК-азы);

- реакция плазмокоагуляции (обнаружение фермента коагулазы);

- продуцирование сероводорода - H₂S;

- продуцирование аммиака;

- ферментация маннита;

- обладать потенциальной гемолитической активностью.

Определение продуцирования стафилококками фермента ДНК-азы. С этой целью применяют следующие компоненты: щелочной МПА (рН 8,4—8,6), рас­твор натриевой соли ДНК (в стерильной дистиллированной воде — 20 мг/1 мл воды) с добавлением нескольких капель 2 %-ного NaOH, хлористый кальций, 1 н. раствор соляной кислоты. Методика определения ДНК-азной активности сле­дующая: к расплавленному охлажденному агару добавляют раствор натриевой соли ДНК (1—1,5 мг/мл), стерилизуют в водяной бане кипячением 30—40 минут. После охлаждения среды до 60°С к ней асептично добавляют хлористый кальций (0,8 мг/мл), разливают в чашки Петри по 10—15 мл. Когда агар застынет (уплот­нится), его подсушивают в термостате, затем засевают на поверхность МПА лег­ким прикосновением петли испытуемую культуру стафилококка, помещают в термостат на 18—20 часа (+37 °С). Получив рост колоний, в чашку вносят 4—5 мл соляной кислоты, которую сливают через 2—3 минут. Чашки просматривают, учитывают результат: просветленная зона вокруг колонии на мутном фоне среды свидетельствует о продуцировании ДНК-азы. Суть реакции в том, что ДНК под действием НСl выпадает в осадок. Продуцируемый патогенными стафилококками фермент ДНК-аза деполимеризует ДНК, и образование осадка не происходит.

Для обнаружения коагулазы (плазмокоагулазы) берут 8 мл крови из сердца кролика иглой, надетой на шприц, промытый 5 %-ным раствором лимоннокисло­го натрия. Содержимое шприца сливают в пробирку с 2 мл 5 %-ного раствора лимоннокислого натрия, осторожно перемешивают. Кролику подкожно вводят 8 мл стерильного физраствора. Пробирки с кровью выдерживают при 4°С для от­стоя эритроцитов или цитратную кровь центрифугируют при 1500— 2000 об/мин. Надосадочная жидкость — плазма (срок годности при хранении в холодильнике 4—5 дней). Плазму разводят физраствором 1:5, разливают в пробирки по 0,5 мл, добавляют по 0,5 мл бульонной культуры стафилококка, встряхивают. Если куль­тура выращена на плотных средах, плазму следует развести 1:10, разлить по про­биркам по 1 мл и в нее внести 1 каплю агаровой культуры. Пробирки встряхива­ют, ставят в термостат при +37 °С. Учитывают через 1, 2, 3 и 24 часа. Положительным результатом будет считаться образова­ние желеобразного или плотного сгустка, что свидетельствует о продуцировании патогенным ста­филококком фермента плазмокоагулазы, фактор патогенности у стафилококков.

Для дифференциации патогенных и непатогенных стафилококков исполь­зуют специальную селективную среду. Тест основан на бактериостатическом действии кристаллвиолета: к 1 л 3,5 %-ного МПА добавляют 3,3 мл 0,1 %-ного кристаллвиолета и сразу разливают асептично в чашки Петри или в пробирки (скошенный агар). Растет патогенный стафилококк, колонии его фиолетового или оранжевого цвета. Непатогенные стафилококки не растут.

Скрытую (потенциальную) гемолитическую способность стафилококков выявляют на 5%-ном кровяном МПА. Для этого бактериологической петлей по диаметру чашки делают прямой полоской посев бета-гемолитического штамма стафилококка. Затем перпендикулярно этой полоске с двух сторон засевают по 4-5 испытуемых штаммов стафилококков. После суточного инкубирования некоторые негемолитические штаммы в непосредственной близости к высеянному бета-гемолитическому штамму стафилококка образуют зону четко выраженного гемолиза.

Для полной характеристики патогенных штаммов также определяют у них способность выделять экзотоксины.

Биопроба: Для выявления патогенности стафилококков применяют и биологическую пробу на лабораторных животных (кролики, котята, белые мыши). Патогенность стафилокок­ков обусловлена продуцируемыми экзотоксинами различной токсической функции: гемотоксины (стафилолизины) - лизируют эритроциты (гемолиз); лейкоцидин — разрушает лейкоциты; и энтеротоксины – вызывают пищевые токсикозы человека. В лабораторной практике чаще определяют летальный токсин и некротоксин. Летальный токсин выявляют внутривенным введением кролику 0,75 мл на 1 кг массы фильтрата бульонной культуры. Некротоксин, со­держащийся в фильтрате бульонной культуры, определяют также биопробой: кролику выбривают участок кожи и дезинфицируют, внутрикожно вводят 0,2 мл культуры (2 млрд микробных тел в 1 мл). Через 24 часа проявляется некротиче­ская реакция (зона некроза развивается в течение 1—2 дней) и образуется инфильтрат. В отдельных случаях (при отравлениях) проверяют наличие стафилококко­вого энтеротоксина. С этой целью биологическую пробу осуществляют на котя­тах пероральным введением (с молоком) исследуемой культуры стафилококка.

Таким образом заключительный бактериологический диагноз основывается на учете описанных характерных морфологических, тинкториальных, культуральнно-биохимических и патогенных свойств выделенной из исследуемого пато­логического материала культуры стафилококка.

Для патогенных стафилококков характерны:

1) гемолиз, 2) ферментация маннита, 3) ДНК-азная активность,

4) рост в среде с добавлением кристаллвиоле­та, 5) реакция плазмокоагуляции,

6) некротизирующая способность, 7) наличие летального токсина.

Контрольные вопросы:

1. Общая характеристика стафилококковых инфекций.

2. Патологический материал, направляемый в лабораторию и схема бактериологиче­ского

исследования.

3. Морфология стафилококков.

4. Культуральные и ферментативные свойства патогенных стафилококков.

5. Методы определения патогенности стафилококков.

6. Методы определения отдельных факторов патогенности стафилококков.