Тема 11. использование в вирусологии культур клеток. культивирование вирусов в культуре клеток

Цель занятия

Ознакомиться с методом получения первично трипсинизированной культуры клеток из тканей куриного эмбриона.

Оборудование и материалы

Куриные эмбрионы 9-12 дневной инкубации, чашки Петри, колбочки по 100 мл, фильтр марлевый, центрифужные пробирки, пробирки стерильные с резиновыми пробками, пипетки, воронки, трипсин, среда 199, раствор Хенкса, центрифуга, магнитные мешалки, магнитики, камеры Горяева, микроскопы, лед, овоскоп, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя

Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступ­ления биологической смерти помещают их в соответствующие питательные сре­ды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использован массово.

МЕТОД ТРИПСИНИЗАЦИИ

Культуры клеток из куриных эмбрионов методом трипсинизации готовят по следующей методике:

1. Подготовка куриных эмбрионов

а) овоскопирование

б) дезинфекция

в) извлечение, измельчение

г) промывание в растворе Хенкса.

2. Трипсинизацию проводят на магнитной мешалке в течение 10 минут подогретым до 35°С 0,25% раствором трипсина. Колбу помещают на тающий лед. Оставшиеся кусочки заливают новой порцией трипсина и трипсинизируют до истощения ткани.

3. Отделение клеток от трипсина.

Взвесь клеток в трипсине центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендируют в небольшом количестве ростовой питательной среды.

4. Подсчет клеток.

Определяют количество клеток в 1 мл суспензии в камере Горяева. Считают клетки в 10 больших квадратах, среднее умножают на 22 000. Подсчет клеток необходим для того, чтобы получить хороший монослой. Для клеток куриного эмбриона оптимальная доза 250-500 тысяч клеток в 1 мл суспензии.

5. Посев клеток.

Вносят в каждую пробирку по 1 мл клеточной суспензии в ростовой среде. Пробирки закрывают резиновыми пробками, помещают на подставку под углом 5-7° и ставят в термостат при +37°.

Рост клеток будет заметен через 12-14 часов после посева, но хороший монослой образуется только через 2-3 дня. Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста.

Метод холодной трипсинизации (рис. 29) используют для диспергирования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят, кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:

а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 – 5 мм, ткань многократно (3–4 раза) промывают раствором Хенкса до полного освобождения от эритроцитов;

б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добав­ляют 0,25%-ный раствор трипсина, в котором перемешивают ткань 10 – 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают и выбрасы­вают;

в) в колбу добавляют свежий раствор трипсина и помещают ее на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не было разбрызгивания и вспенивания жидкости. Перемешивание продолжают в течение ночи (12–16 ч.) при 4-6 °С;

г) утром суспензию фильтруют через 2 – 3 слоя марли или сетку из нержаве­ющей стали в центрифужные флаконы;

д) клетки осаждают центрифугированием при 400 –600 об/мин 20 – 30 мин. Трипсин удаляют;

е) осадок клеток промывают в ростовой среде центрифугированием. Отмы­тые клетки ресуспендируют в ростовой среде, определяют концентрацию, дово­дят ее до посевной и разливают суспензию клеток в сосуды для культивирования.

Рисунок 29 - Последовательность приготовления почечной культуры клеток.

1 – измельчение коркового слоя; 2 – трипсинизация; 3 – осаждение диспергирован­ных клеток центрифугированием, 4 – подсчет живых клеток в гемоцитометре; 5 – диспергирование клеток в среде выращивания, во флаконах Ру; 6 – снятие первично­го монослоя культуры клеток с помощью трипсиноверсеновой смеси, процедура повторного осаждения и подсчета клеток; 7 – суспендирование клеток в среде роста, розлив по пробиркам и инкубация их в стационарных условиях до заражения вирусом