Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

1. Образец, фиксированный нагреванием на предмет­ном стекле, высушивают на воздухе и покрывают его квадратным кусочком промокательной бумаги или сал­фетки, подогнанным по размеру стекла.

2. Насыщают бумагу раствором карболфуксина и выпаривают его 5—10 мин, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере надобности. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.

3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислота—спирт в течение 1 мин; промы­вают водопроводной водой и подсушивают промокатель­ной бумагой.

4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 мин в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения до­бавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окраше­ны в красный цвет, а фон — в черный.

В модифицированном методе Дорнера в пробирке смешивают водную суспензию бактерий с равным объ­емом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подверг­шейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушивания на воздухе образуется тонкий мазок. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

Метод окраски эндоспор по Шефферу -Фултону

В этом методе вместо карболфуксина применяется 0,5%-ный (вес/объем) водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бу­магой или бумажной салфеткой, пропитанной до насы­щения красителем, и помещают на 5 мин. над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой, и мазок дополнительно окрашивают 30 с саф­ранином, как в случае окраски по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают мазок промокательной бу­магой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки—в красно-коричневый.

Метод Виртца в модификации Саватеева

К насыщенному водному раствору (около 5%) малахитовой зелени добавляют 5% глицерина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и высушивают их (лучше при 50°). Затем готовят 0,5% водный раствор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтровальной бумаги, и высушивают. Сохраняют окрашенные бумажки в закрытых банках в защищенном от солнечного света месте.

Техника окраски. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2—3 капли дестиллированной воды и накладывают полоску бумаги, окрашен­ной малахитовой зеленью. Препарат нагревают над пламенем до появления паров (3—4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении вода добавляется. После остывания препарата смывают краску с бумажкой струей водопроводной воды (полминуты) и сейчас же на мокрую поверхность пре­парата кладут бумажку, окрашенную сафранином. Если необходимо, то добавляют несколько капель воды. Через 30—40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: свободно лежащие споры— зеленовато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток—темно-зеленые, вегетативные формы микробов—красные.

Для окраски лучше брать малахитовую зелень в виде двойной соли ZnCl₂ (медно-желтые кристаллы), хуже—щавелевокислая соль (фиолетово-зеленые или ярко-зеленые кристаллы с бронзовым блеском).

Модификация Шеффер и Фултона

1. На фиксированный в пламени мазок наливают насыщенный (5%) водный раствор малахитовой зелени на 30—60 секунд с подогреванием до появления паров (3—4 раза).

2. Краску смывают текучей водой 30—40 секунд.

3. Наливают 0,5% водный раствор сафранина приблизительно на 30 секунд.

4. Промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу.

Микроскопическая картина: споры—зеленые, вегетатив­ные формы—красные.

Способ Пешкова (1924)

Наиболее простой и демонстративный; он не требует химических протрав и дифференцировки. Приготовленный мазок:

1) фиксируют на пламени горелки или смесью спирт + формалин,

2) окрашивают кипящей леффлеровской метиленовой синькой (над пламенем горелки) в течение 15—20 секунд,

3) смывают водой,

4) докрашивают 0,5% водным раствором нейтральрота в течение 30 секунд,

5) промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: споры—голубого или синего цвета, молодые споры—черно-синие, цитоплазма вегетативных форм— розовая, хроматиновые элементы протоплазмы окрашиваются в фиолетовый цвет.

Способ Мюллера:

1) приготовленный на предметном стекле мазок из исследуемой культуры фиксируют на пламени,

2) на мазок наливают 5% водный раствор хромовой кислоты на 1—3 минуты,

3) промывают препарат водой и слегка просушивают,

4) через полоску чистой фильтровальной бумаги красят карболовым раствором фуксина при нагревании (до появле­ния паров) в течение 3—4 минут,

5) обесцвечивают 5% водным раствором серной кислоты в течение 5 секунд,

6) промывают водой,

7) окрашивают допол­нительно леффлеровской синькой 1—2 минуты,

8) промывают водой и вы­сушивают через фильтровальную бумагу.

Микроскопическая картина; споры—красные, вегета­тивные формы—синие.

Способ Ауески

На приготовленный, высушенный на воздухе (нефикси­рованный) мазок наливают 1—2% водный раствор соляной кислоты и подогре­вают на пламени до появления паров (3—4 раза). Затем препарат промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3—5 минут. Потом препарат обесцвечивают 5% водным рас­твором серной кислоты в течение нескольких секунд (до бледно-розовой окра­ски), промывают водой и дополнительно окрашивают леффлеровской метиле­новой синькой или 1% водным раствором малахитовой зелени в течение 2 минут. Краску смывают водой, мазок высушивают.

Микроскопическая картина; споры—красные, вегета­тивные формы—синие (или зеленые).

Способ Клейна:

1) готовят в пробирке густую эмульсию путем смыва исследуемой культуры физиологическим раствором,

2) к эмульсии прибав­ляют равное количество карболового раствора фуксина,

3) пробирку со смесью нагревают на пламени (до появления паров) в течение 5—6 минут,

4) из прогретой смеси приготовляют мазок, высушивают его и фиксируют,

5) обес­цвечивают 1% водным раствором серной кислоты в течение 5—10 секунд,

6) промывают водой,

7) слегка подсушивают,

8) окрашивают леффлеровской синькой в течение 1—3 минут,

9) смывают водой и мазок обсушивают.

Микроскопическая картина: споры—красные, вегета­тивные формы микробов—синие. Недостаток способа—значительный расход краски (фуксина).

Окраска жгутиков

Хотя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем столетие назад, существующие в настоящее время соответствующие методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгу­тиков лежит за пределами разрешения светового микро­скопа (жгутики имеют диаметр около 10—30 нм), для того чтобы их увидеть, необходимо, так сказать, «выма­зать их дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бак­терии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «парализованы». Для обнаружения жгутиков у микробных клеток специальные прописи предусматривают применение протрав, которые способствуют осаждению на жгутиках препаратов железа или серебра,—происходит искусственное на­ращивание поперечника жгутиков, и они лучше видны под микроскопом. При окраске на жгутики, ввиду их хрупкости, необходимо соблю­дать специальные предосторожности, касающиеся как самой культуры и способа изготовления мазка, так и подготовки стекол. Культура, предназна­ченная для окраски на жгутики, должна быть свежей, не старше 12—20 часов роста при соответствующей температуре на твердой среде (преимущест­венно агаровой). Материал с агара берут самым легким прикосновением платиновой петли к сре­де. Затем петлю с материалом вводят в пробир­ку с 2—3 мл стерильной (лучше всего водопро­водной) воды и, держа петлю неподвижно 1—2 минуты или осторожно погружая ее 3—4 ра­за воду, дают самим микробным телам посте­пенно распределиться в воде. Через 15—20 ми­нут, когда микробы равномерно распределятся в среде, платиновой петлей осторожно берут материал и наносят на подготовленное стекло. Нанесенную каплю не размазывают по стеклу, а, дав ей подсохнуть, фиксируют на пла­мени или одним из химических способов фиксации. Предметные или покровные стекла для изготовления препаратов на жгутики должны быть абсолютно чистыми. Обычно стекла для этой цели обрабатывают способу Цетнова. Дальнейшие подробности о технике окраски на жгутики даны при описании отдельных способов.