Метод Труанта окрашивания на кислотоустойчивость

Реактив для флуоресцентной окраски:
Аурамин О, С141000	1,5 г
Родамин В, С1 749	0,75 г
Глицерин	75 мл
Фенол (кристаллы, расплавлен­ные при нагревании)	10 мл
Дистиллированная вода	50 мл

Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фено­лом. Затем добавляют оставшуюся воду и глицерин и снова пере­мешивают. Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4°С или при комнатной температуре.

Растворитель для обесцвечивания:
Этанол 70% (объем/объем)	99,5 мл
Соляная кислота (концентрированная)	0,5 мл
Дополнительный краситель:
Марганцовокислый калий	0,5 г
Дистиллированная вода	99,5 мл

Методика:

1. Погружают слегка фиксированный нагреванием бактериальный мазок на 15 мин. в реактив для флуо­ресцентной окраски при 20—37°С.

2. Промывают мазок под слабой, падающей под уг­лом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным.

3. На 2—3 мин. погружают мазок в обесцвечиваю­щий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше.

4. Погружают мазок в дополнительный краситель на 2—4 мин.

5. Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают промокательной бумагой.

Просматривают образцы в люминесцентный микро­скоп с использованием возбуждающего светофильтра типа BG-12 и запирающего светофильтра типа OG-1. Клетки кис­лотоустойчивых бактерий флуоресцируют желто-оран­жевым светом на темном фоне.

Для микроскопической дифференциальной диагностики туберкулезных палочек от спиртоподатливых сапрофитов, существует несколько методов.

Метод Гонзеля

1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым рас­твором фуксина при нагревании до кипения в течение 2 минут.

2. Промывают водой и высушивают.

3. Обесцвечивают смесью соляной кислоты 3 части и абсолютного или 95° алкоголя 97 частей в течение 10 минут.

4. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синь­ки, разбавленным пополам водой.

5. Промывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные.

Метод Бунге и Траутенрота

1. Помещают препарат на 3 часа в абсолют­ный алкоголь (для извлечения жира).

2. Наливают на мазок 5% водный раствор хромовой кислоты на 15 минут.

3. Промывают водой.

4. Окрашивают при подогревании карболовым раствором фуксина.

5. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 3 минут.

6. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки не менее 5 минут.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные.

Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость)

Препарат окраши­вают карболфуксином при подогревании до появления паров, обмывают водой, а затем красят насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в тече­ние 2—3 минут. Мазок обмывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные на синем фоне, а кислотоустойчивые, но спиртоподатливые палочки—синие.

Если требуется проверить обнаруженные в уже окрашенном по Циль-Нильсену мазке кислотоустойчивые палочки на спиртоустойчивость, нужно: удалить с препарата кедровое масло бензином или ксилолом, докрасить мазок насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 2-5 минут, обмыть водой и высушить. Кислото- и спиртоустойчивые палочки сохраняют свой красный цвет, а спиртоподатливые окрасятся в синий цвет.

Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость)

1) на фиксированный мазок наливают профильтрованную смесь из 10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета и 100 мл 2% карболовой воды (пригодность смеси 3 дня) и нагревают до кипения 4-5 раз с постоянным добавлением свежего раствора краски или же оставляют на 24-48 часов при комнатной температуре;

2) не обмывая водой, на мазок наливают раствор Люголя и держат на мазке 10—15 минут;

3) промывают водой;

4) обесцвечивают сначала 5% раствором азотной кислоты в течение минуты, затем

5) 3% раствором соляной кислоты в точение 10 секунд

6) смесью спирт + ацетон (поровну) до полного обесцвечивания мазка (до прекращения растворения краски);

7) дополнительно окрашивают разведенным фуксином 1 : 10 или 1% водным раствором сафранина в течение нескольких секунд;

8) ополаскивают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: на красном (коричневом) фоне—сине-фиолетовые палочки и резко ограниченные зерна.