Окраска по Граму в модификации Берка

Раствор А:
Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 90% содержанием сухого вещества)	1,0 г
Дистиллированная вода	100 мл.
Раствор Б:
Двууглекислый натрий	1,0 г
Дистиллированная вода	100 мл
Йодная протрава:
Йод	1,0 г
Йодистый калий	2,0 г
Дистиллированная вода	100 мл

Протраву готовят так же, как при модификации Хукера.

Растворитель для обесцвечивания: (Предупреждение: осторожно, легко воспламеняется!)
Этиловый эфир	1 объем
Ацетон	3 объема
Дополнительный краситель:
Сафранин О (с 85% содержанием сухого вещества)	2,0 г
Дистиллированная вода	100 мл

Методика:

1. Высушенный на воздухе фиксированный нагрева­нием мазок погружают в раствор А, добавляют 2—3 капли раствора Б и выдерживают в те­чение 2 мин.

2. Отмывают мазок йодной протравой, после чего покрывают его на 2 мин свежей протравой.

3. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с; поверхность вокруг мазка подсушивают промокательной бумагой, но его самого предохраняют от высыхания.

4. На мазок при наклонном положении предметного стекла по каплям наносят обесцвечивающий раствори­тель до тех пор, пока в скапывающем со стекла раство­рителе не исчезнет окраска. После этого его подсу­шивают на воздухе.

5. На 5—10 с мазок погружают в дополнительный краситель.

6. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают ее промокательной бумагой.

При использовании любой из методик грамположительные бактерии окрашиваются в голубой или фиолето­вый цвет, а грамотрицательные—в красный.

Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальный мазок слиш­ком толст, а обесцвечивание не проведено до конца. В то же время грамположительные микроорганизмы мо­гут выглядеть, как грамотрицательные, если мазок че­ресчур обесцвечен; особенно это характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если нарушена механически це­лостность их клеточных стенок в результате гибели кле­ток, автолиза, действия ферментов (например, лизоцима), высушивания на стекле и последующего увлажне­ния. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные мазки (со слабой замутненностью) из молодых, активно растущих куль­тур, так как более старые культуры имеют тенденцию давать неустойчивые реакции. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Модификация по Синеву.

Вариант Синева заключается в следующем: взамен карболового или анилинового раствора генцианвиолета берут по­лоски фильтровальной бумаги, пропитанные заранее следующим раствором:

Кристаллвиолета	1 г
Спирта 96°	100 мл
Глицерина (не обязательно)

Кристаллвиолет может быть заменен в равных количествах метилвиолетом или генцианвиолетом. Через сутки стояния раствор краски готов и может сохраняться долгое время. Фильтровальную бумагу (один слой), помещен­ную на стекло, обливают указанным раствором краски, высушивают и режут на полоски размером 20´40 мм; бумажки хранят в темной склянке с при­тертой пробкой.

Клемпарская предлагает для окраски препаратов по Граму в модифика­ции Синева при отсутствии фильтровальной бумаги пропитывать 10% спир­товым раствором генцианвиолета полоски обыкновенной газетной бумаги (типографская краска не мешает). Техника во всем та же.

Техника окраски. На фиксированный мазок наливают 2—3 капли дистиллированной воды, опускают и придавливают к стеклу пинцетом полоску бумажки приготовленной вышеуказанным способом. Бумажку через 2 минуты смывают водой или, лучше, снимают пинцетом. Дальше продол­жается обычная обработка раствором Люголя, спиртом или йодированным спиртом, водой и дополнительная окраска.

Модификация по Синеву особенно удобна для походных лабораторий, и экспедиционной работе и т. п.; получаются хорошие препараты, свободные от осадков, при малом расходе краски.

Клемпарская рекомендует готовить красящие бумажки для метода Грама и Циль-Нильсена по следующей прописи: для основной окраски (кристаллвиолет, генцианвиолет и метилвиолет) к 1 г краски добавить 10 мл спирта и 0,5 мл глицерина (краску всыпать в спирт и добавить глицерин), для фуксина—к 0,1 г краски добавить 0,5 мл карболовой кислоты, 3—5 ка­пель глицерина и 10 мл спирта; для дополнительной окраски (сафранин, метиленовая синька)—к 1 г краски добавить 10 мл нагретого до 45—50° спирта, 1 мл насыщенного водного раствора буры и 0,5 мл глицерина (сна­чала нагревают спирт, добавляют буру и глицерин, а затем краску); для раствора Люголя—к 1 г кристаллического йода добавить 2,5 г йодистого калия и 10 мл дистиллированной воды.

Модификация по Эткинсу.

Для данной модификации можно при­менять любую из красок, относящихся к производным парарозанилина (кристаллвиолет, генцианвиолет или метилвиолет), с раствором сернокислого анилина. Растворы красок получаются очень стойкие и совершенно не дают осадков. Для окраски необходимы следующие растворы:

I. Генцианвиолет
Насыщенного спиртового раствора	1 часть
Сернокислого анилина (1% водный раствор)	3 части

При отсутствии готового сернокислого анилина таковой может быть приготовлен следующим образом. К 100 мл 5% водного раствора серной кислоты прибавляют по каплям 20 мл анилинового масла. Выпавший обиль­ный рыхлый белый осадок отфильтровывают, снимают с фильтра и разбав­ляют в 30 мл 95° спирта, а затем снова отфильтровывают и осадок высу­шивают.

II. Раствор йода
Кристаллического йода	2 г
Едкого натра нормального раствора (4%)	10 мл

По растворении прибавляют 90 мл дистиллированной воды.

Для дополнительной окраски применяют спирто-водный сафранин (можно везувин или пиронин): 1 часть насыщенного спиртового раствора краски на 10 частей дистиллированной воды.

Техника окраски:

1) красить мазок раствором I в течение минуты,

2) промыть водой,

3) обработать раствором II в течение минуты,

4) обесцве­тить спиртом в течение 5 минут,

5) дополнительно окрасить в течение 10 секунд,

6) промыть водой и высушить