Тема: Дослідження мікрофлори води

Матеріали та обладнання: 1) мікроcкопи, 2) термостат, 3) електрична плит­ка, 4) спиртівки, 5) стерильні чашки Петрі, 6) стерильні пробірки, 7) стерильні піпетки на 1 мл, 8) пробірки з стерильнім поживним середовищем. 9) конічні колби па 300 мл, 10) сухий поживний агар, 11)карболовий еритрозин, 12) питна вода, 13) забруднена вода, 14) фільтр Зейтца, 15) мембранні фільтри № З, 16) канадський бальзам.

Основні відомості. У воді відкритих водойм є велика кількість різних мікроорганізмів: бактерії, актиноміцети, гриби, найпростіші, водорості тощо. Особливо багато різноманітних мікробів є в за­бруднених органічними рештками водах.

Мікрофлора води істотно відрізняється від мікрофлори по­вітря, її склад насамперед залежить від джерела, з якого взято воду для дослідження. Якщо вода забруднена, то в нійчастіше виявляються такі гнильні бактерії: Васіllus sиbtilis, Рroteus vulgaris, Рsеиdотопаs fluоrеscens та ін. Глибинні води і води артезіан­ських джерел містять мало мікробів. Водопровідна зода вважає­ться доброю, якщо загальна кількість мікроорганізмів в 1 мл ста­новить від 10 до 100, забрудненою — при 500 і більше.

Наявність у воді бактерій кишкової палички та її патогенних - серотипів свідчить про - фекальне забруднення, а також про можливість забруднення цієї води патогенними мікробами. З патогенних для людини бактерій і вірусів у воді можуть траплятися представ­ники кишкової групи бактерій: шигели, сальмонели, холерні віб­ріони, патогенні, серотипи кишкової палички; збудники чуми, бру­цельозу, туляремії; віруси: поліомієліту, епідемічного гепатиту тощо. Ступінь забруднення води мікробами групи кишкової палич­ки оцінюють за колі-титром або колі-індексом.

Найменша кількість мілілітрів води, в якій виявляють хоча б одну клітину ЕзсНегісНіа соїі, називається колі-титром. Кіль-

кість клітин Езскегіскіа соїі виявлених у 1 л води, позначається колі-індексом

В нашій країні проводиться постійний санітарний нагляд і бак­теріологічний контроль за якістю питної води та іншими джере­лами водозабезпечення, що має дуже велике значення для профі­лактики багатьох інфекційних захворювань.

На практичних заняттях студентам можна рекомендувати провести дослідження мікрофлори питної води і води з найближчої річки прискореним методом прямого мікроскопування, запропо­нованим А. С. Разумовим у 1957 р. Суть цього методу полягає в тому, що за 30 хв можна встановити кількісний і якісний склад мікрофлори шляхом прямого мікроскопування препаратів на мемб­ранних фільтрах, через які пропущено певний об'єм досліджуваної води. Одночасно з визначенням кількості бактерій вивчають і морфологічні ознаки їх.

Проведення роботи. В сухі чисті колби беруть проби води (50—100 мл). Підготовляють для роботи мембранні фільтри № 3 ¹, на їх краях тушшю надписують номер проби і вставляють у фільтр Зейтца. Останній з'єднують з насосом (можна брати насос Комовського) і пропускають через мембранний фільтр 10—30мл чистої (водопровідної) або 1 —10 мл води з річки чи озера. Після цього мембранний фільтр з осілими на його поверхні бактеріями підсушують у термостаті при температурі 37-45С його на 5 хв осадом доверху на клаптик фільтрувального паперу, змоченого у 3%-ному розчині карболового еритрозину². Після за­кінчення фарбування фільтр знімають, кладуть у чашку на клап­тик сухого фільтрувального паперу і промивають дистильованою водою для видалення фарби. Операцію повторюють (5—6 разів) до тих пір, поки краї фільтра не стануть слабко забарвленими. Про­миті фільтри знову підсушують і протягом 1—5 хв дофарбовують розчином метиленової синьки. Залишок фарби-видаляють послі­довним перекладанням фільтра на клаптики фільтрувального па­перу, змочені дистильованою водою, щоб краї фільтра стали голу­бими. Відмитий фільтр обережно, щоб не деформувався, висушують і ставлять на краплю імерсійного масла на предметному склі осадом доверху. Зверху на нього наносять другу краплю масла, накривають накривним скельцем і мікроскопують. Для кращого освітлення бажано використовувати світлофільтри (білий, матовий, синій).

Кількість бактерій визначають за такою формулою:

X= n

де х— кількість бактеріальних клітин в 1 мл води; S • 10⁸ — фільт­рувальна площа мембранного фільтра, мкм²;S¹—_; площа одного

¹ Фільтри № 3 кип'ятять двічі по 20 хв у дистильованій воді для. видалення з них повітря і залишків розчинників.

² До 100 мл 5%-ного розчину карболової кислоти додають 3 г сухого еритро­зину, збовтують і фільтрують через паперовий фільтр.

облікового квадратика, мкм²; V— профільтрований об'єм води, мл\ п — середня кількість бактерій в 1 обліковому квадратику (серед­нє з 50 квадратиків).

Вимірювання площі квадратика лічильної сітки проводять, за допомогою об'єкт-мікрометра для кожної пари об'єктива і окуля­ра окремо.

Приклад. Для мікроскопа МБИ-1 з окуляром 15^х і об'єкти­вом 90^х 5 квадратиків лічильної сітки вкладаються в 7 поділок лі­нійки об'єктмікрометра. В цьому випадку розмір однієї сторони квадратика дорівнює 14 мкм, а площа — 196 мкм².

На кожному квадратику, що обліковується, не повинно бути більш як 10—25 і менш як 1—2 бактеріальних клітин, інакше треба буде в першому випадку профільтровувати менший, а в другому — більший об'єм води.

У навчальних лабораторіях можна також досліджувати мікро­флору води при вирощуванні її на поживних середовищах. Для цього беруть у чисті сухі пробірки проби води (водопровідної 5— 10 мл, забрудненої — 1 мл). Водопровідну воду можна не розбав­ляти, а забруднену треба обов'язково розбавляти стерильною водою у таких співвідношеннях: 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000 (чим більша забруд­неність, тим більше розбавлення). З узятих проб води за допомо­гою стерильних піпеток беруть по 1 мл і вносять у пробірки з 10 мл стерильного розплавленого поживного середовища. Суміш швидко перемішують (обертанням пробірки між долонями), обпалюють краї пробірки на полум'ї спиртівки і обережно виливають засіяне середовище в стерильну чашку Петрі (див. рис. 22). Чашки позна­чають і ставлять у термостат на 2—3 дні до наступного заняття. Колонії, що виросли на поживному середовищі, підраховують звичайним способом або (коли їх багато) за допомогою приладу Вольфлюгеля. Зручно¹ також використовувати дляцієї мети і спеці­альний апарат для підрахунку колоній мікроорганізмів (рис. 32).

Якщо посів проводився без розведення, то кількість колоній, яку одержано на площі чашки Петрі, дорівнюватиме вмісту бактерій в 1 мл води. Кількість колоній в чашках з розведенням треба по­множити на відповідне розведення, і тоді одержимо кількість мікробів, яка міститься в 1 мл досліджуваної води.

Лабораторна робота №5

Тема: Кількісний облік мікрофлори грунту бактеріоскопічним методом С. М. Виноградського (в модифікації О. Г. Шульгіної)

Матеріали та обладнання: 1) мікроскопи, 2) апарат для збовтування рідин, 3) предметні і накривні стекла, 4) конічні колби на 250—300 мл, 5) стерильні градуйовані мікропіпетки, 6) 96%-ний спирт, 7) карболовий еритрозин, 8) сте­рильна вода, 9) 0,1%-ний розчин агару, 10) міліметровий папір, 11) кедрова олія, 12) об'ект-мікрометр, 13) досліджуваний грунт, 14) фарфорові ступки, 15) туш.

Основні відомості. Грунт — основне джерело, звідки мікроби надходять у зовнішнє середовище — повітря й воду.

Рис.33. Апарат для збовтування суспензій.

Як зазначалося вище, мікро­флора ґрунту дуже численна і різноманітна. До її складу вхо­дять амоніфікуючі, нітрифікуючі, денітрифікуючі, азотфіксатори, сірко- і залізобактерії, целюлозорозкладаючі, пігментні бакте­рії, гриби, актиноміцети, водорості, найпростіші тощо. У верхніх шарах грунту можуть також бути збудники кишкових інфекцій: дизентерії, черевного тифу, колі-ептериту, холери, епідемічного ге­патиту та і.н.

Кількісний і якісний склад мі­крофлори грунтів залежить від

їх хімічного складу, фізичних властивостей, вмісту вологи й повітря, кліматичних умов, порироку, методів обробки, характеру рослинного покриву та багатьох інших факторів. Оскільки мікрофлора грунту дуже різноманітна (тут живуть аероби, анаероби, автотрофи, гетеротрофи, психро-філи, термофіли тощо), неможливо запропонувати якийсь універ­сальний метод її дослідження, тому користуються різними ме­тодами.

Один із засновників ґрунтової мікробіології — видатний росій­ський мікробіолог С. М. Виноградський — розробив бактеріоскопічний метод визначення кількості бактерій в грунті. Цей метод і тепер широко застосовують у мікробіологічній, практиці. Суть його полягає в тому, що кількість бактерій у грунті визначають прямим підрахунком під мікроскопом. Для цього виготовляють мікро­скопічні препарати з ґрунтової суспензії (з урахуванням ваги і об'єму), забарвлюють еритрозином і вивчають. Виявлену за допомогою мікроскопа кількість мікробів перераховують на 1 г грунту.

Проведення роботи. З середньої проби грунту беруть 5 г, вно­сять його в конічну колбу на 250—300 мл, додають туди 50 мл стерильної води ¹ і збовтують протягом 5 хв на спеціальних апа­ратах (рис. 33). Після збовтування колби залишають на 5 сек, щоб осіли грубі частинки. Потім за допомогою стерильної градуйованої мікропіпетки беруть 0,01 мл суспензії і наносять її на знежирене предметне скло. До суспензії на склі додають краплю 0,01%-ного розчину агару (агар перед цим добре промивається і виготовляєть­ся на дистильованій воді). Суспензію перемішують з агаром і сте­рильним накривним скельцем розподіляють по предметному склу.

¹ Д. Г. Зв'ягинцев (1966) встановив, що коли наважку грунту попередньо зволожити (0,4—0,8 мл води або 0,1%-ного розчину №₂Р20₇ на 1 г грунту) і роз­терти в стерильній ступці протягом 5 хв, щоб грунт мав вигляд пасти, то при цьо­му виявляється на препаратах значно більше мікробних клітин.

за допомогою трафарету¹ на площі 4 см². Після цього-препарат підсушують, фіксують 96%-ним спиртом і забарвлюють карболовим еритрозином (занурюють скло в розчин карболового еритрозину і витримують протягом 30 хв, а при потребі — і більше). За­лишок фарби змивають, занурюючи препарат у воду (тильною сто­роною). Після промивання препарат знову підсушують і вивчають під мікроскопом з імерсійним об'єктивом.

Підрахувати кількість мікробів можна за такою формулою:

де q — середня кількість мікробів в 1 полі зору; S_М — площа маз­ка, см²; S_п.з—площа поля зору, мкм²; 10⁸ — перерахунок на мкм²; С — розведення; V — об'єм суспензії, взятої для дослідження.

Приклад. Щоб дістати точні результати, роблять підрахунок кількості мікробів в 100 полях зору мікроскопа і визначають серед­ню кількість їх на 1 поле зору. Далі визначають площу поля зору за формулою S = πr². Щоб одержати радіус, вимірюють діаметр поля зору за допомогою об'єкт-мікрометра. Після цього визначають, скільки полів зору розміститься на площі препарату (4 см²). Для цього треба поділити площу препарату на площу поля зору. Одер­жану середню кількість мікробів на одне поле зору множать на кількість полів, які позмішуються на площі препарату. В результаті дістають кількість мікробних тілець в 0,01 мл суспензії. Щоб визначити кількість мікроорганізмів в 1 мл суспензії, знайдене число множать на 100. Щоб визначити кількість мікробів в 1 г абсолютно сухого грунту,.треба знайдене число помножити на сту­пінь розбавлення і поділити на наважку абсолютно сухого грунту, що міститься в 1 г сирого грунту.