Отсев характерных колоний на плотную питательную среду с целью получения и накопления изолированных колоний. Чашки инкубируют в анаэробных условиях.
Тема: Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых спорообразующими анаэробными бактериями.
Провести выделение и идентификацию культуры возбудителя, выделенной из глубины раны с подозрением на газовую гангрену.
Микроскопия материала из раны, окраска по Граму, х100 | Микроскопия чистой культуры C. рerfringens, окраска по Граму, х100 |
Результат: | Результат: |
РИФ с меченными АТ к C. perfringens | СЭМ. Морфология C. perfringens, х15000 |
Результат: |
Бактериологическое исследование по выделению и идентификации предполагаемого возбудителя с целью установления этиологии заболевания:
Укажите методы отбора и доставки материала при подозрении на анаэробную инфекцию : _____________
1 этап. Посев исследуемого материала на среды культивирования, укажите какие:________________
Посев исследуемого материала на среду Вильсона-Блера и молоко
Ориентировочный ответ о наличии C. perfringens – через 2-4 ч культивирования.
Контроль(-) Образец | Образец Контроль (-) |
На среде Вильсона-Блера отмечают почернение среды ввиду восстановления сульфата натрия и образования сульфида железа | На среде с лакмусовым молоком образуется сгусток, пронизанный пузырьками газа. |
2 этап. Оценка посева исследуемого материала на СКС или какую-либо среду для выделения анаэробов (анаэробный кровяной агар, среда Китта-Тароцци и т. д.) визуально и микроскопией препаратов, окрашенных по Граму.
Отсев характерных колоний на плотную питательную среду с целью получения и накопления изолированных колоний. Чашки инкубируют в анаэробных условиях.
Оценка результатов посевов: | Микроскопия выделенной культуры, окраска по Граму, х100 |
На среде СКС___________________________. На кровяном агаре колони:________________. | При микроскопии выявлены крупные грамположительные палочки, образующие споры, превышающие диаметр клетки и занимающие субтерминальное или центральное расположение (споры не окрашены). |
3 этап. Характерные колонии отсевают на соответствующие питательные среды для выделения и накопления чистой культуры.
4 этап. Полученная чистая культура подлежит идентификации.
Свойства и методы, позволяющие определить видовую принадлежность. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Методы идентификации: культуральная диагностика, РИФ, ПЦР, биохимический метод («пестрый ряд»), биологический (РН) и др.
Оценка посева культуры на «пестрый ряд» | Обнаружение токсина. Тест на лецитиназную активность | ||||||
Оценка: каталаза (-), разжижение желатина (+), индол (-), глюкоза (+), лактоза (+), сахароза (+), мальтоза (+), пептонизация молока (+), H2S(+), подвижность (-) |
2,3 Контроль(-) |
Проведите идентификацию выделенной культуры по таблице (ниже). Результат________________
5 этап. Оценка результата реакции нейтрализации (РН) на белых мышах с центрифугатом культуральной жидкости и противогангренозными антитоксическими сыворотками.
Для определения токсигенности культуры путем постановки РН смесь центрифугата исследуемой культуры с антитоксическими сыворотками вводят подкожно белым мышам. В случае нейтрализации токсина животные остаются живыми; при отрицательной РН – животные погибают.
№ | Введено животным | Результат | |
культуральная жидкость | антитоксическая сыворотка | ||
1. | + | противоперфрингенс | Мыши живы |
2. | + | противонови | Мыши пали |
3. | + | противосептикум | Мыши пали |
4. | + | противогистолитикум | Мыши пали |
5. | + | противосорделлии | Мыши пали |
6. | + | -- | Мыши пали |
Методы, среды и приборы для создания анаэробиоза
Метод Фортнера.Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов.
Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2 СО3 и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счет образующегося конденсата и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.
Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород.
Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 370.
Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.
Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-450 полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.
Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или ее натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.
Посевы культивируют в термостате.
Биопрепараты
Наименование | Что содержит | Для чего применяется | Как применяется |
Противогангренозные сыворотки диагностические и лечебно-профилактические | представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных анатоксинами (токсинами) трех основных возбудителей газовой анаэробной инфекции (кл. перфрингенс типа А, кл. Новии (эдематиенс), кл. септикум) | Профилактика и лечение гангрены | Профилактическая доза противогангренозной сыворотки составляет 30 000 МЕ (включает по 10 000 МЕ сыворотки активной в отношении токсинов Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum). Лечебная доза суммарно составляет 150 000 МЕ (включает по 50 000 МЕ сыворотки активной в отношении токсинов Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum). Сыворотку вводят медленно в/м, желательно в смеси со стерильным, подогретым до температуры тела физиологическим раствором из расчета 100-400 мл на 100 мл сыворотки. Перед введением основной дозы следует обязательно провести внутрикожную пробу. |
Противостолбнячная сыворотка | представляет собой содержащую специфические иммуноглобулины белковую фракцию сыворотки крови гипериммунизированных столбнячным анатоксином и токсином лошадей. Содержит анатоксины, нейтрализующие столбнячный токсин | Профилактика и лечение столбняка | |
АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина) | убитые клетки возбудителя коклюша, дифтерийный и столбнячный анатоксины | Профилактика коклюша, дифтерии и столбняка | вводят внутримышечно в верхний внешний квадрант ягодицы или передне-внешнюю область бедра в дозе 0,5 мл (разовая доза). Перед прививкой ампулу необходимо тщательно встряхнуть до получения гомогенной суспензии. |
АДС, АДС-М. (Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин) | Препарат содержит в 1 мл 60 флокулирующих единиц (ЛФ) дифтерийного и 20 антитоксинсвязующих единиц (ЕС) столбнячного анатоксинов. | Профилактика дифтерии и столбняка у детей. |
Морфологические свойства микроорганизмов рода Clostridium
Микроскопия чистой культуры C.tetani, окраска по Граму, х100 | СЭМ. Морфология C.tetani, х15000 |
Микроскопия чистой культуры C.botulinum, окраска по Граму, х100 | СЭМ. Морфология C.botulinum, х17000 |
Приложение №2
Медицинская документация
Форма № 204/у
Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030
НАПРАВЛЕНИЕ №____