Выявление морфологических признаков бактерий путем окрашивания.
При изучении морфологических признаков бактерий исследуют форму и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков, способность к спорообразованию. Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток (по Граму) и строению клеточных стенок.
При изучении морфологии клеток в световом микроскопе определяется не только форма клеток, которая может быть в виде палочек, кокков, нитей, но их взаимное расположение, например, в виде цепочек, неравномерных скоплений и т.п и наличие спор. Изучение строения микробных клеток на уровне светового микроскопа возможно при использовании различных методов окраски. В качестве красителей используют фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий и др. в форме спиртовых, водно-спиртовых и водных растворов.
Различают простые, сложные и дифференциальные способы окраски. При простой окраске используют один краситель с выдержкой в течение определенного времени. Сложное окрашивание предусматривает последовательное применение нескольких красителей с промежуточной промывкой и обработкой растворителями (окрашивание по Грамму). Дифференциальное окрашивание основано на индивидуальном отношении структур клетки к разным красителям (окраска спор, капсул).
Простое окрашивание.
1. Приготовление мазка. На обезжиренное предметное cтекло наносят маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно распределяют петлей на площади 1 – 2 см2 тонким слоем.
2. Высушивание. Препарат высушивают при комнатной температуре на воздухе.
3. Фиксация в племени горелки, проводя стеклом в самой горячей части пламени. Фиксация преследует следующие цели: умертвить клетки и сделать их безопасными, прикрепить клетки к стеклу, чтобы они не смывались в результате дальнейших операций, а также для того, чтобы улучшить окрашивание, т.к. мертвые клетки лучше проницаемы для красителей.
4. Окрашивание. Наносят на мазок краситель: метиленовую синь или фуксин. Выдерживают 2 мин., затем краситель удаляют, промывая препарат водой.
6. Высушивание. Окрашенный препарат высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой.
7. На мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.
Выявление живых и нежизнеспособных клеток микроорганизмов.
Метод выявления живых и нежизнеспособных клеток микроорганизмов основан на различной проницаемости красителя в клетки, характеризующиеся различным физиологическим составом. Выявление живых и нежизнеспособных клеток проводят на витальных (прижизненных препаратах) с помощью метиленового синего. Для этого на предметное стекло в каплю микробной суспензии вносят каплю красителя метиленового синего, выдерживают не более одной минуты, накрывают покровным стеклом, оттягивают избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют в проходящем свете. Живые клетки, не воспринимающие краситель, не окрашены, нежизнеспособные клетки окрашиваются в синий цвет.
Сложное окрашивание.
Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски - окраска по Граму.
По результатам такой окраски все бактерии делятся на две группы:
1) Бактерии, удерживающие в клетках комплекс основного красителя с йодом и не обесцвечивающиеся при обработке органическим растворителем. Такие бактерии называют грамположительными (Г +).
2) Бактерии, не удерживающие краситель и обесцвечивающиеся после обработки спиртом. Такие бактерии способны воспринимать дополнительную окраску. Это грамотрицательные бактерии (Г-).
К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бациллы (спорообразующие палочки), актиномицеты, клостридиальные бактерии, дрожжи.
К грамотрицательным микроорганизмам относятся спириллы, сальмонеллы, псевдомонады, азотобактерии, вибрионы, энтеробактерии.
Существуют грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определённых этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для дифференциации используют клетки молодой культуры (односуточной). Для контроля необходимо проводить параллельное окрашивание микроорганизмов, отношение которых к окраске по Граму заранее известно.
Окраску по Граму осуществляют следующим образом:
1. На обезжиренном предметном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в центре - мазок исследуемой культуры, слева и справа - мазки контрольных микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки.
2. Мазки окрашивают в течение 1 мин раствором генцианвиолета.
3. Препарат промывают в слабой струе водопроводной воды.
4. Окрашивают препарат раствором Люголя в течение 1 мин.
5. Промывают препарат в струе водопроводной воды, после чего подсушивают фильтровальной бумагой.
6. Препарат обрабатывают 30 с. 96 %-ным этиловым спиртом (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания (Г- бактерии могут выглядеть как Г+, если обесцвечивание не проведено до конца, а Г+ - как Г-, если препарат сильно обесцвечен).
7. Препарат промывают водой и окрашивают 1 мин раствором фуксина.
8. Мазки промывают водой до исчезновения окраски в стоке, после - высушивают и микроскопируют с иммерсией.
При удачном окрашивании Г+ бактерии окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а Г- в красный.
Экспресс метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену).
Метод основан на разрушении клеточной стенки Г- бактерий в щелочной среде и определении освобождённой ДНК. На предметное стекло наносят каплю 3 %-го раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии и хорошо перемешивают кольцом бактериологической петли. Через 5-10 с при передвижении кольца петли по стеклу при положительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, в этом случае культура тестируется как грамположительная.
Дифференциальное окрашивание.
Окраска спор по методу Циля.
При неблагоприятных условиях для роста и развития некоторые бактерии образуют покоящиеся клетки особого рода - споры (эндоспоры). К образованию эндоспор способны палочковидные грамположительные бактерии (Bacillus, Clostridium), а из кокковидных - единственный род Sporosarcina.
Окраска спор осуществляется следующим образом:
1. На предметном стекле подготавливают два мазка (споро- и неспорообразующей культуры), высушивают на воздухе и фиксируют нагреванием.
2. Препарат покрывают фильтровальной бумагой и насыщают его раствором фуксина Циля, берут пинцетом стекло с одного конца и нагревают над пламенем горелки в течение 1 мин. При этом постоянно добавляют краситель, чтобы он не пересыхал на фильтровальной бумаге.
3. Фильтровальную бумагу удаляют, препарат промывают водопроводной водой.
4. Обесцвечивают препарат 5 %-ным раствором H2SO4 в течение 10-15 с, промывают водой. Вегетативные клетки при этом обесцвечиваются и их дополнительно окрашивают метиленовой синью в течение 2 мин.
5. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.
При правильном окрашивании вегетативные клетки должны быть синими, споры красными, фон - бесцветный.
Окраска капсул по методу Омелянского.
На клеточных стенках некоторых бактерий например, Azotobacter chroococum, наслаиваются снаружи разной толщины слои материала в большинстве случаев из полисахаридов с высоким содержанием воды - это капсулы и слизь. Капсулы и слизи не имеют жизненно важного значения для бактерий, но присутствие капсул обеспечивает более высокую степень их выживания при неблагоприятных условиях, большую резистентность к некоторым патогенным бактериям, повышает их вирулентность.
Выявление капсул осуществляется следующим образом: наносят каплю фуксина Циля на предметное стекло. Помещают в каплю красителя исследуемую культуру бактерий и выдерживают 2-3 мин. Добавляют каплю жидкой черной туши и тщательно перемешивают. Накрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40х либо размазывают суспензию по стеклу, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.
Красители не проникают в капсулу, поэтому бесцветная капсула хорошо видна на общем темном фоне препарата и окрашенных в красный цвет клеток бактерий (негативное окрашивание).
Обнаружение подвижности.
Многие виды бактерий способны к самостоятельному движению с помощью жгутиков. Движение бактериальных клеток лучше всего наблюдать в препарате "висячая капля", используя молодые бульонные или агаровые культуры в возрасте 6-18 ч.
Задание:
1. Провести окраску выросших бактерий по Граму, выявить грамм-принадлежность.
2. Выявить наличие спор в бактериальных культурах окраской по Цилю и последующим микроскопированием с иммерсионным объективом.
3. Приготовить препарата "висячая капля" свежей бактериальной культуры и убедиться в подвижности клеток.